Doy gracias al laboratorio de la iglesia de George el regalo bueno del plásmido pJA1. Agradezco a Fabienne hamburguesa y Alex Boehm del laboratorio Jenal Urs en el Biozentrum de Basilea para ayuda con Conjugación bacteriana y para proporcionar la tensión de BW20767. También agradezco Olin Silander ediciones útiles. Financiación para esta investigación fue proporcionada por los fondos de la Universidad de Massey en Nueva Zelanda y la iniciativa Suiza en biología de sistemas (proyecto "Batalla X" otorgado a Dirk Bumann) en la Universidad de Basilea, Suiza.

PRECAUCIÓN: Si utiliza S. flexneri como una cepa receptora, por favor tenga en cuenta que S. flexneri es un patógeno humano que puede causar enfermedad gastrointestinal. Experimentos con S. flexneri deben realizarse con las precauciones de bioseguridad apropiado (señaladas BSL-2 en Europa y Estados Unidos o PC2 en Nueva Zelanda). Todos los experimentos realizados en el vídeo asociado con este protocolo se realizaron utilizando la cepa receptor bien caracterizada de no patógenas e. coli MG1655 en un entorno de PC1. Trabajo con Shigella flexneri fue realizado previamente en un laboratorio BSL-2 en el Biozentrum de Basilea, como se indica en 6.
 Nota: el siguiente experimento efectivamente se hace dos veces. La primera parte (paso 1.1 - paso 4.5) se realiza para averiguar la mejor dilución de la galjanoplastia de la biblioteca, donde el objetivo es encontrar una dilución de la conjugación que da muchas colonias individuales por placa, pero no tantos forma un césped. Esto es para reducir la competencia entre mutantes con aptitud significativamente reducida y con aptitud más robusto. La segunda parte (pasos 5.1-7.4) es la creación de la biblioteca final, donde se extienden muchas placas de la dilución apropiada de la biblioteca.
 1. para preparar un día antes del experimento <ol><li>inocule, de un stock congelado, la cepa donante en 2 mL de LB caldo, fresadoras receta (NaCl 10 g/l) los medios de comunicación que contiene ampicilina a 100 μg/mL. La cepa donante utilizada aquí es la cepa de e. coli BW20767 15 que el plásmido pJA1 del 11. El uso de la ampicilina mantiene la selección para el plásmido pJA1.</li>
	<li>Inocule, de una sola Colonia o stock congelado, la cepa receptora en 2 mL de medio LB con un marcador de resistencia excepto ampicilina o kanamicina. La cepa receptora utilizada aquí es la e. coli &#34; tipo &#34; tensión MG1655 17 , 18 con un mutante espontánea resistencia a ácido nalidíxico. Se cultiva en el ácido nalidíxico de 30 μg/mL.</li>
	<li>Preparar caldo de Luria de 20 que contienen 1.5% placas de agar (en placas Petri de 90 mM, 12,5 mL aproximadamente). Placas de agar falta antibiótico pueden almacenarse a 4 ° C para varios meses hasta su uso.</li>
	<li>Preparar caldo de Luria de 20 que contienen 1.5% placas de agar (en placas Petri de 90 mM, aproximadamente 12,5 mL) que contiene tanto el ácido nalidixico 30 μg/ml y kanamicina 50 μg/ml (LBA Nal30 Kan50). Placas de agar que contengan antibióticos pueden almacenarse en la oscuridad a 4 ° C para varios meses hasta su uso.</li>
	<li>Preparar 200 mL de medio estéril de la LB. LB medios pueden almacenarse a temperatura ambiente durante varios meses.</li>
	<li>Preparar 1 mL de 100 mM estéril stock de IPTG, según fabricante &#39; instrucciones s.</li>
</ol> 2. Acoplamiento o Conjugación bacteriana <ol><li>mL 1 centrifugadora de cultura durante la noche de la cepa donante durante 1 minuto a 14.000 x g a temperatura ambiente. Desechar el medio de crecimiento. Este paso se realiza para extirpar todos los medios de cultivo que contengan antibióticos.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 110 μl de LB (no contiene antibióticos), concentrando así la cultura.</li>
	<li>Usando pinzas estériles, colocar un filtro de nitrocelulosa estéril (alternativamente un estéril pedazo de papel secante se puede utilizar, consulte materiales lista) en el centro de un plato LBA (no contiene antibióticos). Etiqueta de la placa de &#34; Control negativo: donante &#34;.</li>
	<li>Con una pipeta, drop 50 μl de la cultura donante concentrados en el filtro de.</li>
	<li>Repita los pasos 2.1-4 para la cepa receptora, etiquetado la placa &#34; Control negativo: destinatario. &#34;</li>
	<li>Para la biblioteca, gota de 50 μl de la donante (del paso 2.2) y 50 μl de la cepa receptora (del paso 2.5) en un único filtro estéril en una placa LBA (estas placas no deben contener antibióticos). Esta placa la etiqueta &#34; biblioteca. &#34; acoplamiento se produce porque el donante y el receptor están en contacto estrecho en el filtro de.</li>
	<li>Coloque las placas de agar que contiene los filtros en 37 ° C durante 6 h.</li>
</ol> 3. La activación de transposones pJA1 por IPTG inducción de la transposasa <ol><li>Prepare tres frascos cónicos de 15 mL que contiene 2 mL de LB con IPTG en una concentración final de 1 mM (es decir, 20 μl del stock de 100 mM de IPTG). Etiqueta cada uno: Control de donantes, control del destinatario y biblioteca.</li>
	<li>Quitar las placas de la incubadora después de 6 h de crecimiento a 37 ° C (del paso 2.4). Algún crecimiento bacteriano debe ser visible en el filtro de.</li>
	<li>Usando pinzas estériles, retire el papel de filtro el control de donantes y colóquela en el frasco cónico de 15 mL etiquetado Control de donantes (de paso 3.1). Lo mismo para el Control del destinatario y la biblioteca.</li>
	<li>Toque los tubos para obtener el papel de filtro en el fondo del frasco cónico de 15 mL y garantizar que esté completamente sumergida en lb</li>
	<li>Vortex tubos durante al menos un minuto en high para disociar las bacterias del filtro de nitrocelulosa. El LB debe opacificarse con células bacterianas ( figura 2).</li>
	<li>Utilizar perlas de vidrio estéril o un esparcidor estéril, placa 200 μL de la suspensión de bacterias Vortex control de donantes sobre placas LBA Nal30 Kan50 etiqueta &#34; Control de donantes, 200 μL &#34;.</li>
	<li>Repetir el paso anterior (3.6) para el control del receptor, etiquetado las placas &#34; receptor Control, 200 μL &#34;.</li>
	<li>Repetir el paso anterior (3.7) para la biblioteca, las placas de etiquetado &#34; biblioteca, 200 μL &#34;.</li>
	<li>Hacer diluciones adicionales (es decir, 1:5, diluciones 1:10 y 1: 100, con ayuda de LB que no contengan antibióticos como diluyente) de la biblioteca. Placa 200 μL de biblioteca sin diluir y diluciones adicionales sobre etiquetados apropiadamente las placas LBA Nal30 Kan50.</li>
	Incubadora <li>Coloque placas a 37 ° C por 18 h. Clones con transposones insertados en un gen que causa una pérdida grande de fitness puede tardan más en crecer y aparecer en la placa. Debe haber una variedad de tamaño de las colonias ( figura 3). Placas de tensión receptora y donante deben tener no hay colonias en ellos.</li>
</ol> 4. Elegir la dilución adecuada de la biblioteca para ser utilizado para la biblioteca de mutante Final <ol><li>determinar una dilución de la biblioteca de paso 3.9 que muchas colonias de diferentes tamaños que están espaciadas adecuadamente. El objetivo es conseguir tantas colonias como sea posible sobre una placa, pero no tantas que las colonias se funden en uno con el otro y competirán por los recursos. Este número debe ser aproximadamente de 500-2.000 colonias por placa. Un ejemplo de densidades apropiadas de la Colonia en una placa se muestra en la figura 3.</li>
	<li>Anotar el número de colonias en las placas de.</li>
	<li>Calcular la frecuencia de conjugación (el número de conjugants por la célula receptora). Esto debe estar en el rango de 1 x 10 -4 a 1 x 10 -6 19.</li>
	<li>Determinar el número de mutantes en la biblioteca final basada en aplicaciones posteriores. Muchos usuarios simplemente requieren una biblioteca con mutantes como muchos como sea posible. Para generar mayor cantidad transposon inserciones como teóricamente posible (una inserción cada par de base), objetivo de aproximadaly el mismo número de colonias como pares de bases en el genoma (es decir, ~4.5 x 10 6 para e. coli) para saturar completamente el genoma con todas las inserciones de transposones posible. Es importante tener en cuenta, muchos mutantes que inserciones en esenciales o genes funcionalmente importantes no serán capaces de recuperarse, ya que estas mutaciones serán fatales para el destinatario.</li>
	<li>Calcular cuánto volumen de la biblioteca de inicial se necesita para crear una biblioteca del tamaño deseado. Por ejemplo, el tamaño de la biblioteca deseada es 5 x 10 4 mutantes. La dilución con la mejor separación de las colonias de paso 3.9 fue 200 μL de una 1:10 dilución. El número de colonias en esta placa se estima aproximadamente 2.000 colonias. Si 5 x 10 4 mutantes son necesarios y cada placa tiene 2.000 colonias, entonces se necesitarán 25 placas a esta dilución.</li>
</ol> 5. Creación de la biblioteca de mutante Final <ol><li>Repita los pasos 1 a 3.8, ajustar el número de placas en el paso 1.4 según sea necesario (vea paso 4.4).</li>
	<li>a paso 3.9, la placa la dilución elegida en el paso 4.1 sobre tantas placas como necesario para crear la biblioteca del tamaño deseado (ver paso 4.4).</li>
</ol> 6. Estimar la densidad de la biblioteca <ol><li>contar cuántas colonias allí son por placa y así obtener una estimación aproximada de la biblioteca cómo densa es. Por ejemplo: un total de 2 x 10 5 colonias se platean. El genoma de e. coli MG1655 es alrededor de 4.5 x 10 6 pares de bases. Por lo tanto, una biblioteca con aproximadamente 2 x 10 5 insertos significa que hay una inserción en promedio cada 22 pares de bases y que cada gen debe ser transformado unas 45 veces, dado un gen es de aproximadamente 1 x 10 3 pares de bases. Inserciones de genes esenciales son probablemente muy poco representada en esta biblioteca, y así la densidad en genes no esenciales es probable ser mayor que este. Este tipo de cálculo ofrece uno con un presupuesto amplio de densidad de transposon.</li>
</ol> 7. Agrupación de Transposon biblioteca y almacenamiento <ol><li>después de recuento de colonias, añadir 1 mL de LB (o más, según sea necesario) a la placa de la biblioteca y utilice un esparcidor estéril para raspar las bacterias de la placa. Quitar la suspensión bacteriana y colocar en un frasco cónico de 50 mL o 15 mL. Repita para todas las placas.</li>
	<li>La suspensión de bacterias agrupadas por un minuto completo de vortex para homogeneizar la suspensión.</li>
	<li>Añadir glicerol estéril a una concentración final de 20%.
	<ol><li>Preparar alícuotas de 100 x 20 μl en tubos 0.25 mL de fácil rebrote.</li>
		<li>Preparar al menos dos o más 1 mL de alícuota en crioviales.</li>
	</ol></li> <li>Almacenar todas las alícuotas a -80 ° C</li></ol>

<ol>
	<li>Camacho, L. R., Ensergueix, D., Perez, E., Gicquel, B., Guilhot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+virulence+gene+cluster+of+Mycobacterium+tuberculosis+by+signature-tagged+transposon+mutagenesis.">Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis.</a> Mol Microbiol. 34 (2), 257-267 (1999).</li><li>Hensel, M., Shea, J. E., Gleeson, C., Jones, M. D., Dalton, E., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+bacterial+virulence+genes+by+negative+selection.">Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection.</a> Science. 269 (5222), 400-403 (1995).</li><li>Glass, J. I., Assad-Garcia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+genes+of+a+minimal+bacterium.">Essential genes of a minimal bacterium.</a> PNAS. 103 (2), 425-430 (2006).</li><li>Salama, N. R., Shepherd, B., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+transposon+mutagenesis+and+essential+gene+analysis+of+Helicobacter+pylori.">Global transposon mutagenesis and essential gene analysis of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 186 (23), 7926-7935 (2004).</li><li>Akerley, B. J., Rubin, E. J., Camilli, A., Lampe, D. J., Robertson, H. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+essential+genes+by+in+vitro+mariner+mutagenesis.">Systematic identification of essential genes by in vitro mariner mutagenesis.</a> PNAS. 95 (15), 8927-8932 (1998).</li><li>Freed, N. E., Bumann, D., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Shigella+Tn-seq+data+with+gold-standard+E.+coli+gene+deletion+data+suggests+rare+transitions+between+essential+and+non-essential+gene+functionality.">Combining Shigella Tn-seq data with gold-standard E. coli gene deletion data suggests rare transitions between essential and non-essential gene functionality.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 1-14 (2016).</li><li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn-seq:+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms.">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nature Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li><li>Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+assay+of+every+Salmonella+Typhi+gene+using+one+million+transposon+mutants.">Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants.</a> Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).</li><li>Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+insertion+mutants+within+libraries+by+deep+sequencing+and+a+genome-wide+screen+for+Haemophilus+genes+required+in+the+lung.">Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung.</a> PNAS. 106 (38), 16422-16427 (2009).</li><li>Chan, K., Kim, C. C., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-based+detection+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+transposon+mutants+that+cannot+survive+in+macrophages+and+mice.">Microarray-based detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium transposon mutants that cannot survive in macrophages and mice.</a> Infect and Immun. 73 (9), 5438-5449 (2005).</li><li>Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays.">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li><li>Bender, J., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IS10+transposase+mutations+that+specifically+alter+target+site+recognition.">IS10 transposase mutations that specifically alter target site recognition.</a> The EMBO Journal. 11 (2), 741-750 (1992).</li><li>Shafferman, A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+properties+of+the+beta+origin+of+replication+of+plasmid+R6K.">Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K.</a> J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).</li><li>Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+assay+of+every+Salmonella+Typhi+gene+using+one+million+transposon+mutants.">Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants.</a> Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).</li><li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Daniels, L. L., Kim, S. K., Haldimann, A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+replicative+and+conjugative+plasmids+carrying+lacZ+alpha+for+cloning,+mutagenesis,+and+allele+replacement+in+bacteria.">Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria.</a> Plasmid. 35 (1), 1-13 (1996).</li><li>Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays.">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li><li>Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Sex-factor-affinity+Site+in+E.+coli+as+&#947;&#948;.">Identification of a Sex-factor-affinity Site in E. coli as &#947;&#948;.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 45, 135-140 (1981).</li><li>Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Genome+Sequence+of+Escherichia+coli+K-12.">The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li><li>Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn10+transposon+derivatives+for+insertion+mutagenesis+and+gene+delivery+into+the+chromosome+of+gram-negative+bacteria.">Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.</a> Gene. 160 (1), 59-62 (1995).</li><li>Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+construction+of+pir++Enterobacterial+hosts+for+maintenance+of+R6K+replicon+plasmids.">A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids.</a> BMC Res Notes. 5 (1), 157 (2012).</li><li>Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+and+adaptation+in+a+long-term+experiment+with+Escherichia+coli.">Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.</a> Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).</li><li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).</li><li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+insertion+sequencing:+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms.">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li></ol>

El autor no tiene nada que revelar.

El protocolo aquí descrito permite la construcción de una biblioteca de inserción denso. Este método permite la creación de una biblioteca de transposon con mutantes de transposon único de5 más 2 x 10 bajo usando 5 mL de cultivo volumen6. Es relativamente fácil de realizar, utiliza reactivos disponibles en los laboratorios de Microbiología más básicos, es escalable y requiere poco en el camino de costosos equipos o consumibles como cubetas de electroporación.
Un beneficio importante de este método es que, en teoría, el usuario tiene amplia libertad en la elección de cepas receptoras enterobacterianas. Este papel, así como otros11, utilizar e. coli como una cepa receptora, sin embargo el plásmido pJA1 se ha utilizado con éxito con otras especies destinatarios enterobacterianas como Shigella flexneri6 y enterica de las salmonelas serovar Typhimurium SL134410la tensión. En teoría, el origen γ de la replicación (oriR6Kγ) en pJA1 permite este plásmido en una sede amplia gama19, permitiendo que la cepa receptora es pir +. Recientemente, se han descrito nuevos métodos que permitan la construcción de la pir + en una variedad de cepas enterobacterianas20, dando mayor flexibilidad. Además, la región de300 pares mob del plásmido PI4 en pJA1 permite a transferencia conjugativa de este plásmido a una amplia gama de gram negativos cepas bacterianas19. En pocas palabras, este método podría teóricamente utilizarse con una variedad de cepas receptoras, siempre y cuando se cumplan varias condiciones: la tensión es pir+ y está marcado con una resistencia a los antibióticos distintos de kanamicina y distintos de la cepa donante.
Un paso crítico en el protocolo se encuentra en la estimación de la cantidad correcta de las células de la placa hacia fuera en el paso 4.1. Si las colonias se espacian demasiado de cerca, compiten por los nutrientes en el plato y menos ajuste mutantes son competencia. Esto puede conducir a una reducción en el número total de mutantes. Alternativamente, si las colonias se espacian demasiado lejos aparte, habrá muy pocas colonias en la placa, y el número total de placas de agar necesarios para conseguir una gran biblioteca se convierte en oneroso. Por lo tanto, es importante lograr el equilibrio adecuado en términos de número de colonias por placa.
Es importante realizar los controles enumerados en el protocolo para asegurar que los pasos están trabajando como se describe. En particular, cuando se utiliza ácido nalidíxico como una selección contra contra la cepa de donantes, es importante asegurar que las placas de control de donantes negativos están libres de las colonias. Esto es porque puede haber una tasa baja (aproximadamente 1 x 10-10)21 de espontánea resistencia a ácido nalidíxico, falsos positivos de rendimiento. Por lo general, la tasa de conjugación y transposición es aproximadamente 2 x 10-4 19. Por lo tanto, la tasa de conjugación y transposición es varios órdenes de magnitud mayores que la tasa de la espontánea resistencia a ácido nalidíxico. Por lo tanto, la tasa de falsos positivos en comparación a los eventos de transposición verdadera es muy baja y se considera insignificante cuando está trabajando el protocolo. Sin embargo, si las tasas de conjugación o transposición se reducen significativamente, (de baja eficiencia de acoplamiento y ausencia de inducción del gen de la transposasa con IPTG) y el protocolo es escalar compensar esto, entonces el número de positivos falsos (clones que tiene el transposón insertado) también puede aumentar.
Algunas modificaciones pueden hacerse a los tiempos de incubación en pasos 3.2 y 3.10. Paso 3,2 Estados que verbal debe ocurrir durante 6 h, pero en nuestra experiencia, este paso del tiempo puede ser variado (es decir, 4-7 h) sin cambiar significativamente los resultados. Además, en el paso 3.10, la duración de que las colonias se incuban en las placas de agar también es regulable. Esto puede variar dependiendo el medio de duplicar tasa de crecimiento o tiempo de la cepa receptora. Además, en nuestra experiencia, 18 h produjo una variedad de tamaños de la Colonia, indicando una biblioteca de fitness diversos. Sin embargo, las colonias con aptitud grandemente reducida pueden tomar más tiempo para crecer y así pueden no ser visibles después de 18 h. Si se utiliza este método para encontrar clones de aptitud muy reducida, tiempos de incubación más largos y menos colonias en la placa para reducir hacinamiento (es decir, 48 h, 50-300 colonias) pueden usarse.
Riesgos adicionales de este método son que no es posible utilizar una cepa receptora que ya es resistente a la kanamicina. Es posible cambiar el marcador de resistencia a kanamicina en el plásmido pJA1 para un marcador seleccionable alternativo, tales como resistencia a cloranfenicol para superar este obstáculo. También es importante destacar que, en teoría, es posible utilizar una cepa receptora que es resistente a la ampicilina, como el pJA1 plásmido que contiene el marcador de resistencia a ampicilina se pierde poco después de la transposición.
La creación de una biblioteca de transposon denso en el fondo genético de la opción es potencialmente ventajosa para muchos usos aguas abajo. Por ejemplo, una biblioteca de transposon densa podría utilizarse para identificar a mutantes auxotrófica usando réplica galjanoplastia22 o para identificar a mutantes que son defectuosas en el establecimiento de una infección1,2. Más recientemente, se han reducido los costes de secuenciación de ADN y nuevas tecnologías como la siguiente secuencia de generación se han convertido en comunes, bibliotecas de transposon se han utilizado con profunda secuenciación del ADN para profundizar en la esencialidad del gen, función del gene y genética interacciones. Algunos de estos métodos se revisan en 23 e incluyen métodos tales como secuenciación del sitio de inserción dirigida de transposon (TraDIS), secuencia de transposones (Tn-seq), inserción de alto rendimiento de seguimiento por secuenciación profunda (HITS) y la secuencia de inserción ( INSeq). Todos estos métodos aguas abajo dependen de la construcción de bibliotecas de inserción del transposón denso. Mientras que otros vectores deba utilizarse para determinados métodos aguas abajo, el protocolo descrito aquí da un resumen de los puntos salientes de procedimiento a seguir.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56216/creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial">Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri</a>. The Discussion and References sections have been corrected.
The second paragraph in the Discussion section was updated from:
A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use&#160;E. coli&#160;as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as&#160;Shigella flexneri6&#160;and&#160;Salmonella enterica&#160;serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the &#947; origin of replication (oriR6K&#947;) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is&#160;pir+.&#160;Recently, new methods have been described that allow for construction of the&#160;pir+&#160;in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob&#160;region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is&#160;pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.
to:
A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use&#160;E. coli&#160;as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as&#160;Shigella flexneri6&#160;and&#160;Salmonella enterica&#160;serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the &#947; origin of replication (oriR6K&#947;) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is&#160;pir-.&#160;The&#160;300 base pair mob&#160;region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is&#160;pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.
The References&#160;section was updated from:
<ol start="18">
	<li>Blattner, F. R., Plunkett, G.,&#160;et al.&#160;The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.&#160;Science.&#160;277&#160;(5331), 1453-1462 (1997).</li>
	<li>Alexeyev, M. F., &#38; Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.&#160;Gene.&#160;160&#160;(1), 59-62 (1995).</li>
	<li>Kvitko, B. H., Bruckbauer, S.,&#160;et al.&#160;A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids.&#160;BMC Res Notes.&#160;5&#160;(1), 157 (2012).</li>
	<li>Barrick, J. E., Yu, D. S.,&#160;et al.&#160;Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.&#160;Nature.&#160;461&#160;(7268), 1243-1247 (2009).</li>
	<li>Jacobs, M. A., Alwood, A.,&#160;et al.&#160;Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.&#160;PNAS.&#160;100&#160;(24), 14339-14344 (2003).</li>
	<li>van Opijnen, T., &#38; Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.&#160;Nature Rev Microbiol.&#160;11&#160;(7), 435-442 (2013).</li>
</ol>
to:
<ol start="18">
	<li>Blattner, F. R., Plunkett, G.,&#160;et al.&#160;The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.&#160;Science.&#160;277&#160;(5331), 1453-1462 (1997).</li>
	<li>Alexeyev, M. F., &#38; Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.&#160;Gene.&#160;160&#160;(1), 59-62 (1995).</li>
	<li>Barrick, J. E., Yu, D. S.,&#160;et al.&#160;Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.&#160;Nature.&#160;461&#160;(7268), 1243-1247 (2009).</li>
	<li>Jacobs, M. A., Alwood, A.,&#160;et al.&#160;Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.&#160;PNAS.&#160;100&#160;(24), 14339-14344 (2003).</li>
	<li>van Opijnen, T., &#38; Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.&#160;Nature Rev Microbiol.&#160;11&#160;(7), 435-442 (2013).</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56216/creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial">Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri</a>.&#160;The Discussion and References sections have been corrected.

Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

La creación de bibliotecas de transposon mutagénesis en bacterias es útil para una amplia variedad de aplicaciones, que van desde el descubrimientos de genes de virulencia en patógenos bacterianos1,2, a los estudios de genes esenciales3, 4 , 5 , 6, a la identificación de la interacción genética de redes7,8,9. Crítica a estos estudios es la posibilidad de crear una gran biblioteca de mutantes. El uso de transposones (fragmentos cortos de ADN que se inserta al azar en un genoma) es un medio simple de interrumpir las funciones de los genes, como la inserción de un transposón dentro del marco de lectura abierto o región reguladora de un gen a menudo interrumpirá la función o expresión del gen.
Se describe aquí es un método para la creación de una biblioteca de transposon en e. coli o S. flexneri por conjugación bacteriana utilizando el plásmido pJA110. Hay dos ventajas principales a usar este plásmido. La primera ventaja es que la variante de la transposasa Tn10 expresada desde el plásmido pJA1 es inducible y tiene inserción baja diagonal11,12, lo que significa que el transposon se integrará al azar en el genoma cuando isopropílico Β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) es añadido a los medios de comunicación. El transposón contiene un marcador de resistencia a kanamicina, permitiendo la selección de mutantes con las inserciones de transposones en el cromosoma de la cepa receptora. La segunda ventaja del plásmido pJA1 es que contiene un origen mutante R6K de replicación. El origen mutante R6K de replicación requiere el gen de la pir de lambda en orden para el mantenimiento del plásmido13. Como el plásmido no se puede replicar en pir - cepas, se perderá en la cepa receptora (figura 1). Esto asegura que Tn10 transposasa se saca de la celda y ya no está activa, reduciendo aún más las mutaciones después del evento de transposición inicial.
El uso de la conjugación bacteriana para pasar el plásmido pJA1 de la cepa donante a la cepa receptora es ventajoso por varias razones. Conjugación es simple y barata de realizar y no necesita equipo especial como un electroporator. Además, la alta eficiencia de conjugación bacteriana permite una biblioteca muy grande (&#62; 2 x 105 inserciones únicas) que se alcanzará con unos pocos mililitros (mL) del cultivo bacteriano durante la noche6. El proceso toma alrededor de dos horas de tiempo práctico junto con tiempo para la incubación y crecimiento de las bacterias. Langridge et al. 14 registrados realizar 130 electroporations para crear una biblioteca de mutagénesis de transposon de un tamaño similar a la descrita aquí8, que se consigue con una sola conjugación. El uso de 130 electroporations requiere mano de obra intensiva y desperdiciador de tiempo preparación de células de espectro y el uso de muchos materiales costosos (por ejemplo, cubetas de electroporación), a un costo de más de $1,000 USD en solo consumibles. Otros estudios10 han utilizado métodos similares, pero con diferentes cepas bacterianas y alcanzado ahora biblioteca pequeños (5 x 104 unidades formadoras de colonias) que informó aquí.
Notas sobre la cepa donante: el donante utilizado aquí es la cepa de e. coli BW2076715 que contiene el pJA1 transposon plásmido16. BW20767 cepa puede conjugado a otras cepas, haciendo la transferencia del plásmido pJA1 altamente eficiente. También, sobre todo, BW20767 es lambda pir +. Como se mencionó anteriormente, el plásmido pJA1 sólo es capaz de mantenerse en las cepas que contienen el gen de la pir de lambda. Esta variedad es kanamicina y ampicilina resistente. El plásmido pJA1 contiene el marcador de resistencia a ampicilina y un marcador de resistencia a kanamicina está dentro de los transposones. Esta variedad se cultiva con la selección en el plásmido con ampicilina a 100 μg/mL. Es también vale la pena destacar que otras cepas que constitutivamente expresado transposasa genes son conocidos por ser inestable y mientras la transposasa utilizado aquí es bajo inducible de control, existe un riesgo bajo de expresión agujereado. Por esta razón, se sugiere que debe reducirse al mínimo el paso de esta variedad y una racha fresca debe tomarse de una cultura congelada para cada preparación de biblioteca nueva. La cepa donante utilizada aquí está disponible en nuestro laboratorio a petición.
Notas sobre la cepa receptora: la cepa receptora puede ser una variedad de elección, como las cepas de laboratorio derivado de K12 de e. coli o cepas de S.flexneri (también, vea discusión). La cepa receptora debe tener un marcador de resistencia antibiótica adicional que no es resistencia a la kanamicina, para que la cepa donante puede ser seleccionada contra. Para la cepa receptora, una cepa de e. coli MG1655 se utiliza aquí con una mutación espontánea introdujo el ácido nalidíxico. Mutante espontánea ácido nalidíxico fue seleccionado por la galjanoplastia 2 ml de la cultura durante la noche en 200 partes alícuotas μL en placas que contienen el ácido nalidixico 30 μg/ml. Una sola copia de MG1655 fue seleccionada que era resistente al ácido nalidíxico para convertirse en la cepa receptora. Además, la cepa receptora debe ser lambda pir negativo, como se describe anteriormente.
Resumen: Una vez que la conjugación bacteriana ha producido y el plásmido pJA1 ha pasado de la cepa donante a la cepa receptora, la adición de IPTG a los medios de comunicación inducen la expresión del gene del tnp , que está bajo control de IPTG-inducible Ptac de lacIq promotor (figura 1). El gen del PNT en pJA1 es una transposasa mutante que tiene una menor frecuencia de inserción en puntos calientes6,10,11. Incorporación e inducción con IPTG, el transposón es activado e inserta al azar en el genoma. El plásmido no se puede mantener en la cepa de pir-receptor de lambda y se pierde.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">0.45 micron nitrocellulose filters (sterile)</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">HAWP02500</td>
			<td style="width:179px;">Alternatively blotting paper can be used (listed below)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:335px;">Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper</td>
			<td style="width:171px;">GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 &#215; 57 cm</td>
			<td>3030-917</td>
			<td style="width:179px;">Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Metal Forceps, sterile</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>MURRE009/01</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume,&#160; 12.5 mL working volume.</td>
			<td style="width:171px;">Interlab New Zealand</td>
			<td>2303-1090</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:335px;">Sterile glass spreaders</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>NZNZSPREADER</td>
			<td style="width:179px;">Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below)</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:335px;">Sterile glass beads</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>HERE1080603</td>
			<td style="width:179px;">Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Nalidixic acid (optional)</td>
			<td style="width:171px;">GoldBio.com</td>
			<td style="width:119px;">N-015-250</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">Ampicillin sodium salt BioChemica</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>APLIA0839.0025</td>
			<td style="width:179px;">prepare according to manufacturer recommendation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Kanamycin sulfate BioChemica</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>APLIA1493.0010</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">IPTG (Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside)&#160;</td>
			<td>Thermofisher New Zealand</td>
			<td>FMTR0393</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">Difco Agar granulated</td>
			<td style="width:171px;">Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand</td>
			<td style="width:119px;">214530</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Luria Broth Base (Miller&#39;s LB Broth Base)</td>
			<td style="width:171px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">12795-084</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Glycerol bidistilled 99,5 %</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>VWRC24388.320</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">15 ml polypropelene sterile conical vials&#160;</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>CORN430791</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>AXYGMCT-175-C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td style="width:119px;">BDAA352070</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Equipment</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Incubator at 37C</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Autoclave for sterilizing media&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation of a dense transposon insertion library using bacterial conjugation in enterobacterial strains such as escherichia coli or shigella flexneri

Mutagénesis de Transposon es un método que permite la interrupción del gene a través de la inserción genómica al azar de un pedazo de ADN llamado un transposon. El protocolo a continuación describe un método para la transferencia de alta eficiencia entre cepas bacterianas de un plásmido que un transposón que contiene un marcador de resistencia a kanamicina. La transposasa transmitidas por plásmidos es codificada por un gen variante PNT que inserta el transposón en el genoma de la cepa receptora con muy bajo sesgo de insertional. Este método permite así la creación de grandes bibliotecas mutantes que transposons se han insertado en posiciones genómicos únicos en una cepa receptora de bacterias o Escherichia coli o Shigella flexneri . Mediante el uso de la conjugación bacteriana, en comparación con otros métodos como la electroporación o transformación química, se pueden crear grandes bibliotecas con centenares de miles de clones únicos. Esto produce las bibliotecas inserción alta densidad con inserciones que ocurren tan frecuentemente como cada 4-6 pares de genes no esenciales. Este método es superior a otros métodos ya que permite un método barato, fácil de usar y de alta eficiencia para la creación de una biblioteca de inserción del transposón denso. La biblioteca de transposon puede utilizarse en aplicaciones posteriores como transposon secuencia (Tn-Seq), para inferir redes de interacción genética, o más simplemente, en mutacional (adelante genético) pantallas.

Después de 18 horas de crecimiento, las placas deben contener muchas colonias con una gran variedad de tamaño de las colonias (figura 3). Tamaño de las diferentes colonias indica clones de fitness diferentes y es una buena señal de que el protocolo ha trabajado. Los controles del donante y el recipiente deben tener no hay crecimiento en las placas. Utilizando el protocolo anterior debe generar más de 2 x 105 unidades formadoras de colonias (UFC). Ampliar el protocolo de cinco conjugaciones replicadas a la vez debe generar aproximadamente 1 x 106 UFC. En trabajos anteriores, utilizando la siguiente secuencia de generación el análisis indicó que debe generar una biblioteca tan mayor &#62; 2 x 105 inserciones único6. En UFC muy alta (es decir, 1 x 106 UFC) la tasa de inserción única se espera que de la meseta, como todas las inserciones disponibles (no fatales) ser representadas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig1.jpg"> 
Figura 1 : Esquema de la conjugación bacteriana e inserción del transposón en el cromosoma. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig2.jpg"> 
Figura 2 : Imagen de filtros sumergida en LB medios antes y después de un vórtex. Antes de Vortex, las células están atrapadas en el filtro y los medios de comunicación son evidente. Después de Vortex, los medios de comunicación se convierte en turbia como las células se hayan apagado el filtro y en los medios de comunicación. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig3.jpg"> 
Figura 3 : (A) placa representativa de biblioteca transposon después de 18 h de crecimiento. (B) cerca del tamaño de las colonias. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri at JoVE.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presentado aquí es un método simple para crear una biblioteca de inserción del transposón alta densidad en Escherichia coli o Shigella flexneri mediante Conjugación bacteriana. Este protocolo permite la creación de una colección de cientos de miles de mutantes únicos en bacterias por la inserción genómica al azar de un transposón.

Creación de un denso Transposon inserción biblioteca usando Conjugación bacteriana en cepas enterobacterianas tales como Escherichia Coli o Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

15.8K vistas.  Massey University. Presentado aquí es un método simple para crear una biblioteca de inserción del transposón alta densidad en Escherichia coli o Shigella flexneri mediante Conjugación bacteriana. Este protocolo permite la creación de una colección de cientos de miles de mutantes únicos en bacterias por la inserción genómica al azar de un transposón.

Video: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

El uso de<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; Para estudiar las interacciones Autophagy Citoesqueleto

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Modelo no invasiva de neuropatogénico<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La infección en Neonatología Rata

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. pylori-induced gastric inflammation by activating several innate leukocytes including neutrophils, monocytes, and mast cells. The immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP make it a potential diagnostic and vaccine candidate for H. pylori and a new drug candidate for cancer therapy. In order to obtain substantial quantities of purified HP-NAP used for its clinical applications, an efficient method to purify this protein with high yield and purity needs to be established.
In this protocol, we have described a method for one-step negative chromatographic purification of recombinant HP-NAP overexpressed in Escherichia coli (E. coli) by using diethylaminoethyl (DEAE) ion-exchange resins (e.g., Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP constitutes nearly 70% of the total protein in E. coli and is almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0. Under the optimal condition at pH 8.0, the majority of HP-NAP is recovered in the unbound fraction while the endogenous proteins from E. coli are efficiently removed by the resin.
This purification method using negative mode batch chromatography with DEAE ion-exchange resins yields functional HP-NAP from E. coli in its native form with high yield and purity. The purified HP-NAP could be further utilized for the prevention, treatment, and prognosis of H. pylori-associated diseases as well as cancer therapy.

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

A high yield method for one-step negative purification of recombinant Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) overexpressed in Escherichia coli by using diethylaminoethyl resins in batch mode is described. HP-NAP purified by this method is beneficial for the development of vaccines, drugs, or diagnostics for H. pylori-associated diseases.

De un solo paso negativo Purificación cromatográfica de<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; La proteína activadora de neutrófilos sobreexpresa en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En modo batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Detección de la colonización de Escherichia Coli enterohemorrágica en anfitrión murino no invasiva In Vivo el sistema de bioluminiscencia

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpresión y Purificación de Humanos<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasa en<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

Alto rendimiento de secuenciación paralelo a la idoneidad de la medida de Leptospira interrogans Transposon inserción mutantes durante oro sirios Hamster infección

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Un protocolo fácil de generar proteínas Site-Specifically acetiladas en Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Replicación de la ordena, no redundante biblioteca de Pseudomonas aeruginosa cepa PA14 mutantes de inserción de transposones

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...