Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología sobre la frecuencia con la que el ADN plásmido puede propagarse entre diferentes bacterias. La principal ventaja de esta técnica es que al reducir el fondo, podemos detectar pequeñas diferencias en la frecuencia de conjugación con una alta resolución. Demostrando el procedimiento estará Kosuke Yanagiya, un estudiante graduado de mi laboratorio.
Para calcular la frecuencia de conjugación por el número más probable, mate de filtro un mililitro de un cultivo de donante nocturno con un mililitro de un cultivo receptor nocturno durante 45 minutos a 30 grados centígrados, como acaba de demostrar. Mientras el cocultivo está incubando, diluir en serie los cultivos originales de donante y receptor para el enchapado en triplicado en el caldo de Luria donante, o LB, además de kanamicina, o LB receptor más placas de gentamicina para un cultivo de dos días a 30 grados Celsius. Al final de la incubación, resuspender el cultivo en el filtro en LB estéril que contiene kanamicina y gentamicina para dilución en serie en una placa de cultivo celular de 96 pocillos en cuadrruplicado.
Después de dos días a 30 grados centígrados, cuente manualmente las unidades formadoras de colonias, o UFC, en las placas de agar del donante y receptor y el número de pozos en los que los transconyugantes crecen por microscopía ligera. Para calcular el número más probable y su desviación, abra el programa de cálculo MPN. Introduzca el nombre y la fecha del experimento, el número de la serie de pruebas y el número máximo de diluciones en la fila siete de la hoja de programa del archivo de hoja de cálculo.
En las tablas de datos de entrada producidas automáticamente, introduzca la fórmula en la columna del factor de dilución D, 0,01 en el volumen en la columna mililitros o GW y cuatro en la columna número de tubos N. Introduzca el número de pozos en los que crecieron los transconjugadores en cada dilución de la muestra y haga clic en calcular los resultados para obtener los resultados como el número más probable por mililitro, y los límites de confianza superiores e inferiores del 95%. A continuación, divida el número de transconjugantes por el número de unidades formadoras de donantes y colonias receptoras por mililitro para calcular la frecuencia de conjugación de los plásmidos.
En este experimento representativo, la frecuencia de conjugación de ambos plásmidos aumentó a tasas de agitación más altas con una diferencia máxima en la frecuencia de conjugación observada entre cero y 400 RPM para cultivos introducidos en el plásmido pBP136:gfp, y entre cero y 200 RPM para cultivos que se introdujeron en el plásmido pCAR1:gfp. Para determinar la densidad de las células receptoras necesarias para comparar la probabilidad de conjugación, se realizaron ensayos de apareamiento con diferentes densidades de donantes y receptores. En este experimento representativo, se detectaron transconjugantes pBP136:gfp en el 100% de los pozos que contenían una vez 10 a la tercera CFU del donante y de uno a 10 a la quinta a una por 10 a la séptima CFU del receptor, y aquellos con una vez 10 a la segunda CFU del donante y una por 10 a la sexta a la séptima CFU a la séptima CFU del receptor, y aquellos con un tiempo 10 a la segunda CFU del donante y una por 10 a la sexta a la séptima CFU a la séptima CFU del receptor , lo que indica que la densidad celular era demasiado alta.
Sin embargo, los ensayos de apareamiento con 10 UFC de donante y 10 a la sexta o 10 a la quinta CFU del receptor resultaron en una disminución del número de pozos positivos transconjugant. Por lo tanto, se predijo que se requería de 10 a la quinta CFU del receptor para el apareamiento con una sola célula donante. Los ensayos de apareamiento con pCAR1:gfp en diferentes densidades de cepas de donantes y receptores demostraron hallazgos similares, aunque en general los porcentajes de pozos positivos transconjugant fueron mucho más bajos que los de pBP136:gfp.
Suponiendo que las células donantes y receptoras puedan unirse entre sí de manera similar, la probabilidad de iniciación de conjugación para el donante pCAR1 fue menor que la del donante pBP136. Sobre la base de estos resultados, se estimó que se requerían entre 10 y séptimo receptor de la CFU para una sola célula donante ordenada por FACS. Después de contar el número de pozos positivos transconjugant, se determinó que el porcentaje de pozos positivos transconjugant para pBP136:gfp era mayor que el de pCAR1:gfp, lo que demuestra una diferencia de más de 36 veces en la probabilidad de que el donante iniciara la conjugación entre estos dos plásmidos.
Al intentar el procedimiento, es importante recordar siempre diluir las mezclas bacterianas cuidadosamente.
