El autor desea agradecer a todos mis estudiantes de pregrado de Investigación Independiente y todos mis estudiantes de posgrado Fisiología Microbiana que probaron mis ideas de mutagénesis de transposón durante los semestres de primavera 2010-2014. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Estatal de Youngstown.

1. La electroporación de células competentes 5,11 <ol><li> Diluir una O / N LB cultura de Enterobacter sp. YSU 1/20 en 50 ml de medio LB fresco y crecer con agitación a 120 rpm y 30 ° C a una OD (600 nm) entre 0,4 y 0,6. Opcionalmente, crecer otras cepas bacterianas a su temperatura de crecimiento óptima. </li><li> Chill las células en hielo durante 5 min y se centrifuga a 4 ° C y 7000 xg durante 5 min. </li><li> Descartar el sobrenadante, resuspender las células en 50 ml de agua enfriada con hielo estéril y se centrifuga a 4 ° C y 7000 xg durante 5 min. Repita este paso. </li><li> Descartar el sobrenadante y resuspender las células en un volumen de agua fría de hielo igual al volumen de sedimento de células. Para el almacenamiento a largo plazo, se lavan las células con 10 ml de hielo frío 10% (v / v) de glicerol, se resuspende en un volumen igual de pellets de hielo frío 10% (v / v) de glicerol, almacenar a -80 ° C, y descongelar en hielo antes de la electroporación. </li><li> Añadir 0,5 l de la transposome a 40 l delas células. La solución transposome disponible comercialmente se suministra a una concentración de DNA de 0,33 g / l. Aunque se recomienda 0,33 mg, 0,165 g de ADN es suficiente. </li><li> Coloque la mezcla de células / transposome en un hielo frío, 0,2 mm, cubeta de electroporación y toque la mezcla a la parte inferior de la cubeta. Choque de las células a 25 mF, 200 Ω y 2,5 kV. Para asegurarse de que las células permanecen refrigerados, almacenar las cubetas de electroporación en un congelador a -20ºC antes de su uso. </li><li> Inmediatamente, añadir 960 l de caldo de filtro esterilizado súper óptima con represión catabólica (SOC) medio. Mezclar pipeteando arriba y abajo y transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril. NOTA: Las células empiezan a morir después de la descarga, pero la sal en el medio SOC les permite recuperarse. Para economizar, no es necesario añadir transposome o al choque de las células de control negativo. Sólo tiene que añadir 960 l de medio SOC estéril a ella. </li><li> Se incuban las células a 30 ° C fo 45-60 min con agitación a 120 rpm. Esto proporciona tiempo para la transposome para recombinarse con el genoma del huésped y por las células para expresar resistencia a la kanamicina. </li><li> Corre 100 l de células en una placa de agar LB-kan y se incuba la placa de O / N a 30 ° C. Guarde la mezcla de transformación que queda en el refrigerador a 4 ° C. Corre cantidades adicionales en una fecha posterior hasta 2 semanas después de la electroporación inicial, si es necesario. </li></ol> 2. Gridding de transformantes <ol><li> Cinta de una rejilla a la tapa de un vacío de 100 x 15 mm plato de petri. Copiar una rejilla de &quot;Un Curso Corto en Genética Bacteriana&quot; 12. </li><li> Dibuje una línea en la parte inferior de una placa de agar LB-kan. Utilice un pequeño trozo de cinta para anclar a la tapa de cuadrícula de modo que la rejilla es visible a través del agar. Asegúrese de que la línea en la parte inferior de la placa está alineada con la parte superior, centro de la rejilla. El anclaje de la placa con cinta mantiene que se deslice, lo que permite incluso grillado. La línea facilita la identificación de colonias después de la réplica en placa. </li><li> Escoja un único transformante con un palillo de dientes estéril y detectar en el centro de una plaza en la parrilla. Sólo tiene que tocar la colonia y el lugar. No cavar el palillo de dientes en el agar. Para evitar la contaminación de la placa, manejar el palillo de dientes sólo en un extremo. </li><li> Detectar otro transformante en una casilla adyacente como en el paso 2.3. Cuando la placa está llena, se incuba O / N a 30 ° C. Este es el plato principal. </li></ol> 3. Réplica galjanoplastia para determinar el fenotipo auxotroph 12 <ol><li> Para cada placa que fue cuadriculada, hacer una pila de tres placas de agar frescas numeradas del uno al tres: una para LB-kan, dos para M-9-kan y tres para LB-kan. Secar las placas al revés, O / N, a 37 ° C antes de su uso. </li><li> Dibuje una línea en la parte superior de cada placa como en el paso 2.2. </li><li> Limpie la herramienta de réplica en placa con etanol al 70%, colocar un cuadrado de terciopelo estéril en la parte superior de la chapa réplica aol y sujetar la plaza pana abajo. Las manos están llenas de microbios, incluso después de lavarlas. Evitar la introducción de contaminación de microbios por el manejo de la plaza de la pana por los bordes. </li><li> Alinear la línea en el plato principal con una línea dibujada en la abrazadera y coloque la placa en la parte superior de la plaza de pana. Aplique una leve presión para transferir las bacterias de la placa de la plaza de pana. Tenga cuidado de no manchar las bacterias. Retire la placa principal de la plaza de pana. </li><li> Alinear la línea trazada en la placa con el número uno de la línea en la pinza y colocarla en la parte superior de la plaza de pana. Aplique una leve presión para transferir la bacteria de la plaza de la pana a la placa. Retire la placa de número uno. </li><li> Deseche la plaza de pana en un vaso de agua y colocar un cuadrado de terciopelo limpio, estéril en la herramienta de réplica en placas como en el paso 3.3. Este paso evita la sobre-inoculación que provoca el crecimiento de avance y resultados falsos positivos. </li><li> Alinear lalínea en la placa de número uno con la línea en la pinza y colocarla en la parte superior de la nueva plaza de pana. Aplique una leve presión para transferir las bacterias de la placa de número uno a la plaza de pana. Retire la placa de número uno. </li><li> Alinear la línea trazada en la placa número dos con la línea en la pinza y colocarla en la parte superior de la plaza de pana. Aplique una leve presión para transferir la bacteria de la plaza de la pana a la placa de número dos. Retire la placa de número dos. </li><li> Repita el paso 3.8 para la placa número tres. La tercera placa es un control para la transferencia completa de la placa maestra a las otras dos placas. Deseche la plaza de pana en un vaso de agua. Para volver a utilizar las plazas de pana, autoclave el vaso que contiene los cuadrados de pana contaminados, lavarlos, secarlos, envolverlos en papel de aluminio y volver a autoclave ellos. </li><li> Las placas se incuban a 30 ° CO / N. Las colonias que crecen en ambas placas de agar LB-kan pero no logran crecer en placas M-9-kan se considera que son auxótrofos ( <strong&gt; Figura 2). </li><li> Streak cabo auxotrofos de placa de número uno en una placa de agar LB-kan fresca, e incubar la placa a 30 ° CO / N. </li><li> Streak a cabo para el aislamiento de 3 colonias de la placa de racha en el paso 3.11 en una placa de LB-kan fresco. Incubar la placa a 30 ° CO / N. Esto asegura que el mutante está bien aislado. Dividir el plato en tres partes y la racha fuera cada colonia en una sección. </li><li> Colonias spot de las colonias con rayas a cabo derivadas de paso 3.12 en una placa de LB-kan fresca para formar una cuadrícula como en los pasos 2.1 a 2.4. Cada mutante está siendo re-probado por triplicado. </li><li> Replicar placa de nuevo como en los pasos 3.1 a 3.10 para confirmar el fenotipo auxótrofo. </li></ol> 4. Gen Rescate <ol><li> Cultivar un 3 ml O / N cultura de una colonia mutante aislado de la etapa 3.13 en medio LB-kan líquido a 30 ° C. Se purifica el ADN genómico a partir de 1 ml de cultivo usando un kit de purificación de ADN genómico disponibles comercialmente. </li><li> Configurar una mezcla de 0,025 UEndonucleasa de restricción BFU CI y 14 l de 1 mg / l de ADN genómico en una reacción de 20 l en hielo. Desde BFU CI corta el transposón en doce sitios diferentes, puede ser más eficaz utilizar la endonucleasa de restricción, Bfa I o Hae III, que corta el transposón en dos y tres sitios diferentes, respectivamente. </li><li> Incubar la reacción a 37 ° C durante 25 min y después a 80 ° C durante 20 min para inactivar la enzima. Analizar 3 l de la ADN parcialmente digerido en un gel de agarosa al 0,8% (Figura 3). A exitosos resultados parciales de digestión en una mancha de por encima de 10 kb hacia abajo a la parte inferior del gel. </li><li> Ligar 15 l de ADN genómico parcialmente digerido usando 800 unidades de ADN ligasa de T4 en una reacción de 500 l. Incubar la reacción de O / N a 4 ° C. El volumen de reacción grande maximiza la ligación de fragmentos individuales a sí mismos y minimiza las interacciones entre dos o más fragmentos de ADN. </li><li> Precipitate el ADN se ligó mediante la adición de 50 l de acetato de sodio 3 M, pH 5,5, y 1 ml de etanol de 95% y la incubación a -20 ° C durante 20 min. </li><li> El ADN de microcentrífuga a 4 ° C y 13.500 xg durante 10 min, se lava el sedimento con etanol al 70%, se seca en un concentrador de vacío centrífuga, y resuspender en 10 l de agua libre de nucleasa. Alternativamente, el ADN puede ser secada al aire a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Utilice 4 l de ADN se volvió a suspender para transformar E. coli cepa pir ECD100D o ECD100D pir116 por electroporación como en la sección 1. El origen de replicación γ R6K requiere una cepa bacteriana con un gen pir a replicar 6. Los resultados cepa pir en los plásmidos de copia bajos, y la cepa pir116 contiene un gen mutante pir que resulta en plásmidos de copias elevados. Cada transformante contiene un nuevo plásmido con el transposón y una región del cromosoma interrumpida (Figura 1E). </li><li> Inoculcomió 5 ml de medio LB-kan con una sola colonia, crecer O / N con agitación a 120 rpm y 37 ° C, y purificar ADN plasmídico a partir de la cultura entera O / N utilizando un kit comercial. </li><li> 14 l de digerir el plásmido usando la endonucleasa de restricción Xho I. Asegúrese de que el volumen final de la reacción es de 20 l. Esta enzima reconoce un sitio en el centro del transposón en el extremo 5 &#39;del gen de resistencia a kanamicina. Analizar 10 l de la plásmido no digerido y digerido en un gel de agarosa al 0,8% (Figura 3). El plásmido consiste en el ADN del huésped 2 transposón kb además de acompañamiento. </li></ol> 5. Secuenciación de ADN <ol><li> Secuenciar el plásmido usando un kit de secuenciación disponible comercialmente, cebadores que son homólogas a cada extremo del transposón, y un sistema de análisis de secuenciación capilar. Alternativamente, el plásmido puede ser enviado a una institución fuera para la secuenciación. </li><li> Utilice el patrón de peso molecular (escalera de 1 kb) enel gel para estimar el tamaño del plásmido. Luego, estimar el número de nanogramos (ng) de plásmido que se requiere para el 50 fmol. </li><li> Medir la concentración del ADN plásmido usando un espectrofotómetro a longitudes de onda de 260 nm (A 260) y 280 nm (A 280). Asegúrese de que la longitud del recorrido de la luz a través de la cubeta es de 1 cm. Determinar la concentración multiplicando la absorbancia a 260 nm por 50 ng / l. ADN plásmido de alta calidad tendrá una A 260 / A 280 ratio de entre 1,8 y 2,0. </li><li> El volumen de ADN requerida para cada reacción de secuenciación es el número de ng requerido para 50 fmol dividida por la concentración del plásmido. Mezclar el volumen del plásmido requerido con el agua para llevar el volumen total hasta 10 l. </li><li> Calentar la mezcla de ADN plásmido / agua a 96 ° C durante 1 min y luego enfriar a RT. </li><li> Añadir 8 l de mezcla maestra del equipo de secuenciación y 2 l de 1,6 M de uno de los cebadores de secuenciación. </li><li> Folbajo el protocolo del kit de secuenciación para el programa de termociclador y la limpieza de reacción. </li><li> Analizar cada muestra usando un sistema de análisis de ADN capilar. </li><li> Use un paquete de software disponible en el mercado para ver la secuencia de ADN. Búsqueda de la secuencia &quot;5&#39;-GAGACAG-3 &#39;,&quot; que es el último 7 pb del transposón (Figura 4). La secuencia antes del extremo 5 &#39;de este segmento 7 pb pertenece al transposón. La secuencia después del extremo 3 &#39;de este segmento 7 pb pertenece al gen interrumpido. </li><li> Determinar la posible función del gen interrumpido con el Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8 Básica. Utilice la siguiente link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> . Pegue la secuencia de la interrupcióngen ed en el cuadro de búsqueda, seleccione &quot;otros&quot; en virtud de la base de datos y haga clic en &quot;BLAST&quot; en la parte inferior de la página. Cuando el resultado aparece, desplácese hacia abajo la página para ver los resultados de la alineación (Figura 5). </li></ol>

<ol>
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El autor no tiene nada que revelar.

Transposón mutagénesis usando un transposome es una herramienta eficiente para generar auxotrofos en Enterobacter sp. YSU y otros tipos de bacterias Gram negativas y Gram positivas 3,4. El proceso se inició mediante la introducción del Tn 5 transposome -derivado en el huésped por electroporación. Para identificar colonias con insertos, la cepa no transformada objetivo tenía que ser sensibles a la kanamicina para seleccionar para el marcador de resistencia llevado por el transposón. A...

Prototrophic bacterias crecen en M-9 que contenían medio mínimo de sales glucosa (M-9) medio, la conversión de glucosa a través de vías centrales del metabolismo de carbono para generar precursores, tales como aminoácidos, ácidos nucleicos y vitaminas, para la biosíntesis de 1. M-9 medio contiene cloruro de amonio como fuente de nitrógeno, sodio y fosfato de potasio como un tampón y fuente de fósforo, sulfato de magnesio como una fuente de azufre y glucosa como fuente de carbono y energía. Luria-Bertani (LB) medio es rico en aminoácidos de triptona y en vitaminas y factores de crecimiento a partir de extracto de levadura. Es compatible con el crecimiento de los auxótrofos que no pueden sintetizar aminoácidos, vitaminas y otros factores de crecimiento necesarios para el crecimiento en medio M-9. Por lo tanto, prototrofos crecerán en LB y medio M-9, mientras que auxótrofos crecerán en medio LB, pero no en medio M-9. Mediante la introducción de mutaciones en una población prototrophic de bacterias y la identificación de genes mutados que causan fenotipos auxotróficas, es possible para obtener una mejor comprensión del metabolismo en una cepa bacteriana. Mutagénesis de transposón puede ser usado para identificar muchos de los genes necesarios para el crecimiento en glucosa en medio M-9. Los transposones se insertan aleatoriamente en el genoma huésped 2. Mediante la identificación de transformantes transposón en placas de agar LB y réplica en placas sobre placas de ellos M-9 de agar de medio, es posible para la detección de auxótrofos. Genes interrumpidos se identifican a través de rescate de genes. Este estudio utiliza un comercialmente disponible Tn 5 -derivado transposome que se suministra como una solución de un segmento de ADN transposón lineal mixto con la proteína transposasa. El segmento de ADN carece de un gen de la transposasa, pero contiene un gen de resistencia a la kanamicina, un origen de replicación γ R6K y dos motivos de mosaico que son secuencias de ADN para la transposasa de unión en cada extremo del segmento de 3,4. Dado que la proteína transposasa se añade directamente al ADN, el segmento de ADN solose define como el transposón, y el complejo de proteínas de ADN / transposasa se define como la transposome. El transposome se transformó por electroporación en un 5 kanamicina sensibles host (Figura 1A). Las colonias que crecen en placas de agar LB que contenían kanamicina (LB-kan) tienen inserciones de transposones (Figura 1B), y réplicas de chapado en transformantes que no crecen en M-9 placas de medio de agar que contiene kanamicina (M-9-kan) son auxótrofos (Figire 1C). El ADN genómico de un mutante es purificado y parcialmente digerido con la endonucleasa de restricción de corte 4-base, BFU CI (Figura 1D). El ADN ligado se transformó en una cepa de Escherichia coli (E. coli) que contiene el gen pir (Figura 1E). Este gen permite que el nuevo plásmido que contiene el transposón y región flanqueante cromosómico del huésped para replicarse en E. coli 6. El gen de resistencia a kanamicina sirve como comomarcador elegible para el nuevo plásmido. Por último, la secuenciación usando cebadores complementarios a cada extremo del transposón y Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8 análisis de la secuencia resultante se usan para determinar la identidad de los genes interrumpidos. Esta estrategia de mutagénesis transposome ofrece tres ventajas 3. En primer lugar, ya que la proteína transposasa se une directamente a la transposón, la inserción no depende de la expresión del gen transposasa dentro del huésped. Una vez que el transposón se incorpora en el genoma huésped, la transposasa se degrada, impidiendo el movimiento adicional del transposón. Sin embargo, el movimiento adicional que no se puede evitar si el host posee un 5 Tn elemento transposicional endógeno. En segundo lugar, la introducción de la transposome por electroporación hace que sea posible su uso en una amplia variedad de huéspedes. También elimina la necesidad de introducir el transposón por conjugación bacteriana o por viinfección ral. Ambos procesos requieren la susceptibilidad del huésped. En tercer lugar, la inclusión del gen de resistencia a kanamicina y el origen de replicación R6K γ en el transposome hace que sea más fácil identificar el gen interrumpido. Regiones de tipo transposón interrumpida se pueden almacenar y se secuenciaron como plásmidos, lo que elimina la necesidad de utilizar la reacción en cadena inversa de la polimerasa (PCR) para la identificación de genes. El protocolo presentado en este video se describe cada paso por transposón mutagénesis de Enterobacter sp. YSU 9 usando un transposome de su introducción en las células bacterianas a la identificación del gen putativo se interrumpió. Además de los protocolos publicados previamente 3,4,10, se presentan métodos detallados para el uso de réplica en placa para detectar auxotrofos. Esta técnica de mutagénesis puede utilizarse para la investigación de otros fenotipos, tales como antibióticos y resistencias de metal, en diferentes tipos de bacterias, por identifying el número mínimo de genes necesarios para el crecimiento en condiciones de cultivo definidos en los estudios de biología sintética, o para la enseñanza de un componente de laboratorio de una genética o curso de fisiología microbiana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="707">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Tn5 R6K&#947;ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">TSM08KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir+ Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">ECP09500</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a low copy number</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">EC6P095H</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a high copy number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5X M-9 Salts</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">DF048517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lennox LB Broth</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1427-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J637-1KG</td>
			<td style="width:227px;">Solid media contained 1.6% (w/v) agar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kanamycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0408-25G</td>
			<td style="width:227px;">When required, media contained 50 &#956;g/ml kanamycin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D-Glucose Monohydrate</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J850-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J859-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;">0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BfuC I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0636S</td>
			<td>Partial digestion of genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xho I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td>Plasmid digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nuclease Free Water</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">E476-1L</td>
			<td style="width:227px;">For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GenomeLab DTCS - Quick Start Kit</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">608120</td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1120A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1460</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replica Plating Block</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Velveteen Squares</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-2</td>
			<td>Replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PetriStickers</td>
			<td style="width:145px;">Diversified Biotech</td>
			<td style="width:119px;">PSTK-1100</td>
			<td>Grid for replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Pulser II</td>
			<td style="width:145px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Electroporation Cuvettes &#8211; 2 mm</td>
			<td style="width:145px;">BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">E-5010-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CentriVap DNA Vacuum Concentrator</td>
			<td style="width:145px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970010</td>
			<td>Drying DNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CEQ 2000XL DNA Analysis System</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vector NTI Advance 11.5.0</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12605099</td>
			<td>DNA sequence analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of enterobacter sp. ysu auxotrophs using transposon mutagenesis

Prototrophic bacterias crecen en M-9 mínimo de sales suplementado con glucosa (M-9) medio, que se utiliza como fuente de carbono y energía. Auxótrofos se pueden generar utilizando un transposome. El comercialmente disponible, Tn 5 transposome -derivado utilizado en este protocolo consiste en un segmento lineal de ADN que contiene un origen de replicación R6K γ, un gen para resistencia a la kanamicina y dos secuencias de mosaico extremos, que sirven como sitios de unión de transposasa. El transposome, siempre como un complejo de proteínas de ADN / transposasa, se introdujo por electroporación en la cepa prototrófica, Enterobacter sp. YSU, e incorpora al azar en el genoma de este host. Los transformantes son réplica en placas sobre agar Luria-Bertani placas que contenían kanamicina, (LB-kan) y en placas de agar M-9 medio que contiene kanamicina (M-9-kan). Los transformantes que crecen en placas de LB-kan pero no en placas M-9-kan se considera que son auxótrofos. Genómico purificadoADN de un auxótrofo se digiere parcialmente, se ligó y se transformó en un pir + Escherichia coli (E. coli) cepa. El origen de replicación R6Kγ permite que el plásmido se replica en pir + E. cepas de E. coli, y el marcador de resistencia a kanamicina permite la selección del plásmido. Cada transformante posee un nuevo plásmido que contiene el transposón flanqueado por la región cromosómica interrumpido. Secuenciación de Sanger y la Local Alignment Search Tool Básica (BLAST) sugieren una identidad supuesta del gen interrumpido. Hay tres ventajas de utilizar esta estrategia de mutagénesis transposome. En primer lugar, no se basa en la expresión de un gen de transposasa por el anfitrión. En segundo lugar, la transposome se introduce en el host de destino mediante electroporación, en vez de por conjugación o por transducción y por lo tanto es más eficiente. En tercer lugar, el origen de replicación R6Kγ hace que sea fácil de identificar la mutación geno que se recupera parcialmente en un plásmido recombinante. Esta técnica se puede utilizar para investigar los genes implicados en otras características de Enterobacter sp. YSU o de una variedad más amplia de cepas bacterianas.

Transformación de Enterobacter sp. YSU por electroporación con el transposome inició la inserción del genoma al azar en el genoma huésped (Figura 1A, B). Un electroporación éxito produjo varios miles de transformantes que crecieron en placas LB-kan. Para obtener 300-400, colonias por placa bien espaciadas, se ha optimizado la cantidad de transformación mezcla de propagación en cada placa de agar LB-kan. Cada transformante contenía al menos una inserción de transposón, pero no estaba...

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Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU crece en glucosa medio mínimo de sales. Auxótrofos se generan mediante la transformación con un transposome que se inserta aleatoriamente en el genoma huésped. Los mutantes se encuentran por réplica en placas de medio complejo a medio mínimo. Genes interrumpidos se identifican por el rescate y la secuenciación de genes.

Generación de<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU auxótrofos Usando transposón mutagénesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

generation-enterobacter-sp-ysu-auxotrophs-using-transposon

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

13.8K vistas.  Youngstown State University.  Enterobacter sp. YSU crece en glucosa medio mínimo de sales. Auxótrofos se generan mediante la transformación con un transposome que se inserta aleatoriamente en el genoma huésped. Los mutantes se encuentran por réplica en placas de medio complejo a medio mínimo. Genes interrumpidos se identifican por el rescate y la secuenciación de genes. 

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Investigación

Biología

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagénesis dirigida casera de plásmidos enteros

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Generación de ADN / ARN híbridos en el ADN genómico de transformación utilizando oligonucleótidos de ARN que contiene

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

Introducción al Laboratorio de Worm: El cultivo de gusanos de Mutagénesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagénesis y funcional protocolos de selección de la evolución dirigida de proteínas en E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Único ovocito Mutagénesis bisulfito

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Eficiente iPS Generación Celular de sangre usando episomas y HDAC inhibidores

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Un protocolo para la evaluación funcional de la Proteína Total-mutagénesis de saturación Bibliotecas La utilización de secuenciación de alto rendimiento

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...