Anexina V y propidio yoduro (PI) el etiquetado de células es una técnica utilizada para identificar la muerte de la célula y distinguir entre sus diferentes vías: apoptosis, o programado muerte celular y necrosis. Las células experimentan cambios morfológicos distintos dependiendo de la vía. Al identificar las condiciones específicas que conducen a una célula a la apoptosis o necrosis, los científicos obtienen penetración en fisiología celular y la fisiopatología de la enfermedad. Anexina V y PI etiquetado, seguido por citometría de flujo, se ha establecido como uno de los métodos más eficientes para categorizar el tipo de muerte celular.
Hoy, describiremos cómo este análisis ayuda en la identificación de las vías de muerte celular, de cómo llevar a cabo esta técnica y algunos interesantes experimentos de ejemplo que utilizan este método para responder preguntas importantes en el campo de la biología celular.
En primer lugar, echemos un vistazo a los principios de la anexina V y PI la coloración.
Como se mencionó anteriormente, las células apoptóticas exhiben características morfológicas distintivas. Estos incluyen la contracción de la célula, blebbing de membrana, fragmentación nuclear y la aparición de cuerpos apoptóticos. Además, después de la inducción de la apoptosis, es decir, en la etapa temprana de la apoptosis, aparecen ciertos cambios característicos en la membrana. Una membrana de la célula normal tiene la fosfatidilserina o residuos de PS en el prospecto interno. Sin embargo, en células apoptóticas tempranas algunos de estos residuos de PS se translocan a la superficie externa, pero ¿cómo?
Para entenderlo, vamos a dar un paso atrás. Durante la apoptosis, es bien sabido que se activan caspasas citosólicas. Estas enzimas a su vez activan una enzima unida a la membrana llamada scramblase. Scramblase "descompone" la membrana celular por translocación de residuos de PS desde el lado citoplasmático a la superficie externa. En contraste, durante la necrosis PS residuos permanecen donde están, pero la membrana se rompe. Anexina V y PI etiquetado aprovechar estas diferencias en las alteraciones de la membrana de los dos tipos de muerte celular.
Anexina V conjugada con el tinte fluorescente, como el isotiocianato de fluoresceína, comúnmente conocido como FITC-es un ligando de la membrana impermeable, natural de PS y por lo tanto fácilmente identifica temprano células apoptóticas atando a PS externalizada. Sin embargo, tras la ruptura de la membrana, que ocurre durante la necrosis y también durante etapas posteriores de la apoptosis, anexina también pueden enlazar a PS en la cara interna y dar falsos positivos.
Para evitar esto, los científicos utilizan PI. Esta molécula de ADN vinculante tinte es impermeable la membrana y sólo puede entrar en una célula cuando se rompe la membrana. Por lo tanto, si una célula es annexin sólo manchado lo es apoptótica temprana, mientras que una célula que es PI y annexin manchado podría ser apoptóticos o necróticos o finales.
Ahora que usted ha aprendido los principios básicos detrás de este ensayo, vamos a ir a través del procedimiento de tinción y análisis de la muerte celular.
En primer lugar, las células cosechadas y se centrifugó a baja velocidad para evitar cualquier alteración morfológica y resuspendió en buffer de lavado fisiológicas tales como tamponada fosfato salino, también conocido como PBS. Tras otro paso de centrifugación, las células se resuspendió en anexina V tampón vinculante que contiene calcio, que es necesario para anexina enlace a PS. anexina V conjugada con FITC entonces se agrega a la solución, que se incuba a temperatura ambiente en la oscuridad para permitir la anexina y Asociación de PS. En el siguiente paso, PI es directamente a la anexina tinción solución celular y se incubó en la oscuridad. Después de la incubación, las células son lavadas en PBS por centrifugación, suspendidas en tampón de lavado y mantenidas en hielo. Ahora están listos para el análisis.
Actividad de fluorescencia de las células es analizada por citometría de flujo, una técnica basada en el laser que captura datos de fluorescencia de las células suspendidas en una corriente de fluido. Después de la calibración de la fluorescencia usando células teñidas por separado con cada tinte, se adquieren datos de dos células. Señales de fluorescencia de la población de células se utilizan para crear una trama donde intensidad de annexin-limite FITC se traza en el eje logarítmico y PI en el eje logarítmico. Células que son FITC anexina positivas y negativas de PI se agrupan en la parte inferior derecha de la parcela, que representa las células apoptóticas tempranas, y doble positivos células anexina-FITC y PI se producirán en la parte superior derecha, que representa la apoptosis tardía o células necróticas. Las células que permanecen sin manchas o insignificante manchada para anexina y PI son células vivas.
Ya que ahora sabes por qué los biólogos de la célula dependen de esta técnica para estudiar la muerte celular, por qué no repasamos algunas de sus aplicaciones.
Mediante este procedimiento, los científicos pueden seguir que proteínas intracelulares participan en la apoptosis. En este video, los investigadores analizaron el efecto de cisplatino, un fármaco contra el cáncer, en células del riñón normal para ver si induce apoptosis. Un conjunto de células fue transduced para sobreexpresar una forma activa de la enzima proteína cinasa de C o PKC, y el otro conjunto era transduced con una forma no funcional, PKC negativa dominante. Las células expresando PKC y tratados con cisplatino experimentaron la apoptosis con el tiempo, pero las células que expresan la PKC negativo dominante inactivo fueron resistentes a la apoptosis, indicando que la enzima es un jugador clave en la vía de apoptosis inducida por cisplatino.
Los investigadores también utilizan estas manchas para probar el potencial citotóxico de células T específicas. Células de T citotóxicas puede reconocer proteínas de membrana específicas en su célula diana e inducir su muerte en Unión a él. Aquí, los investigadores incubaron antígenos específicos de células T con las células del tumor blanco y anexina V y luego observó inducción de apoptosis de las células tumorales por el compromiso de la célula de T. Flujo de datos de citometría reveló el porcentaje de muerte de la célula objetivo en presencia y ausencia de células de T citotóxicas.
Por último, los científicos utilizan este método para evaluar la viabilidad de las células después de la entrega del gene. En este caso, los investigadores quisieron evaluar la supervivencia de la célula después nucleofection — un método que utiliza una combinación de productos químicos y un campo eléctrico aplicado para crear transitoria los poros en las membranas celulares y nucleares, facilitando la entrega del gene. Mediante el uso de anexina V más un tinte llamado D 7-aminoactinomycin o 7-AAD, que, similar a PI se une al ADN, demostraron eso muerte de baja celular nucleofection causada por apoptosis o necrosis.
Sólo has visto video de Zeus de anexina V y PI etiquetado. En este video, nosotros brevemente discuten las características distintivas de la apoptosis y las células necróticas, revisó los principios detrás de este método, visto comúnmente un procedimiento generalizado para esta técnica y previsualizar algunas aplicaciones. Dada la importancia de entender cómo las diferentes células mueren bajo diferentes condiciones, anexina V y PI etiquetado sirve como una herramienta importante para biólogos de célula interesado en este fenómeno. ¡Como siempre, gracias por ver!
