Annexin V und Propidium Jodid (PI) Kennzeichnung von Zellen ist eine Technik verwendet, um Zelltod zu identifizieren und seine verschiedene Wege unterscheiden: Apoptose, oder programmierter Zelltod und Nekrose. Zellen durchlaufen unterschiedliche morphologische Veränderungen je nach dem Weg. Durch die Identifizierung der spezifischen Bedingungen, die eine Zelle Apoptose oder Nekrose unterziehen führen, Wissenschaftler gewinnen Einblick in die zelluläre Physiologie und Pathophysiologie der Erkrankung. Annexin V und PI Beschriftung, gefolgt von Durchflusszytometrie, entstand als eine der effizientesten Methoden, um die Art der Zelltod zu kategorisieren.
Heute beschreiben wir, wie dieser Test hilft bei der Identifizierung von Zelle Tod wegen gewusst wie: führen Sie diese Technik und einige spannende Beispiel Experimente, die diese Methode verwenden, um wichtige Fragen auf dem Gebiet der Zellbiologie zu beantworten.
Zunächst werfen wir einen Blick auf die Prinzipien hinter annexin V und PI Färbung.
Wie bereits erwähnt, weisen Apoptotic Zellen morphologische Besonderheiten. Dazu gehören Zelle Schrumpfung, Membran Blebbing, nukleare Fragmentierung und die Darstellung des apoptotischen Körper. Darüber hinaus folgende Induktion der Apoptose – d. h. Apoptotic frühzeitig – bestimmte charakteristischen Veränderungen erscheinen auf der Membran. Eine normale Zelle Membrane hat die Phosphatidylserin oder PS-Rückstände auf dem inneren Merkblatt. Jedoch im frühen Apoptotic Zellen sind einige dieser PS-Rückstände an der äußeren Oberfläche umgesiedelt – aber wie?
Um zu verstehen, dass, gehen wir einen Schritt zurück. Während der Apoptose ist es bekannt, dass cytosolische Caspasen aktiviert werden. Diese Enzyme aktivieren wiederum eine Membrane-springen-Enzym namens Scramblase. Scramblase verschlüsselt"" der Zellmembran von translocating PS Rückstände aus der zytoplasmatischen Seite zur Außenfläche. Im Gegensatz dazu während Nekrose PS bleiben Rückstände wo sie sind, aber die Membran selbst Brüche. Annexin V und PI Kennzeichnung nutzen diese Unterschiede in der Membran Veränderungen der zwei Arten von Zelltod.
Annexin V konjugiert mit fluoreszierenden Farbstoff wie Fluorescein erfolgt – gemeinhin als FITC – ist eine Membran undurchlässig, natürlichen Liganden für PS, und daher leicht identifiziert frühen Apoptotic Zellen durch die Bindung an die externalisierte PS. Anschluss an Membran-Bruch, die während der Nekrose und auch in späteren Phasen der Apoptose, Knochenoder auftritt kann jedoch auch binden an PS auf der Innenseite und falsch positive Ergebnisse liefern.
Um dies zu vermeiden, verwenden Wissenschaftler PI. Dieses DNA-bindenden Farbstoff Molekül ist wieder Membran undurchlässig, und kann nur eine Zelle eingeben, wenn die Membran gebrochen ist. Wenn eine Zelle ist, dass nur Knochenoder es gefärbt also frühen Apoptotic während eine Zelle PI und annexin gebeizt nekrotische oder späten Apoptotic sein könnte.
Nun, da Sie die grundlegenden Prinzipien hinter dieser Assay gelernt haben, gehen Sie wir durch das Verfahren der Färbung und Zelltod zu analysieren.
Erstens sind Zellen geerntet und zentrifugiert bei niedriger Drehzahl, morphologische Störungen zu verhindern und Nukleinsäuretablette in physiologischen waschen Puffer wie Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, auch bekannt als PBS. Im Anschluss an ein weiterer Zentrifugationsschritt Zellen sind Nukleinsäuretablette in annexin V Bindung Puffer, enthält Kalzium, was notwendig für Knochenoder Bindung an PS. Annexin V mit FITC konjugiert ist dann die Lösung, die bei Raumtemperatur im Dunkeln Knochenoder und PS-Vereinigung ermöglichen ausgebrütet wird hinzugefügt. PI ist im nächsten Schritt direkt hinzugefügt, um die annexin Zelle Färbelösung und im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubation sind Zellen durch Zentrifugation mit PBS-Puffer gewaschen, Nukleinsäuretablette im Puffer waschen und auf Eis gehalten. Jetzt sind sie bereit für die Analyse.
Fluoreszenz-Aktivität der Zellen ist durch Durchflusszytometrie, eine Laser-basierte Technik analysiert, die Fluoreszenz-Daten von einzelnen Zellen in einem Strom von Flüssigkeit suspendiert erfasst. Nach der Fluoreszenz-Kalibrierung mit Zellen, die separat mit jeder Farbstoff gefärbt werden Daten aus dual gefärbten Zellen erworben. Fluoreszenz-Signale von der Zellpopulation werden verwendet, um einen Plot erstellen, wo annexin-gebundenen FITC Intensität auf der logarithmischen X-Achse und PI auf der logarithmischen Y-Achse aufgetragen. Zellen, die annexin-FITC-positiv und negativ PI wird auf der rechten unteren Seite des Grundstücks, cluster repräsentieren die frühen Apoptotic Zellen und Zellen doppelt positiv für annexin-FITC und PI wird rechts oben, Vertreter der späten Apoptotic oder nekrotischen Zellen auftreten. Live sind die Zellen, die ungefärbten oder unwesentlich gebeizt für Knochenoder und PI bleiben.
Da Sie nun wissen, warum Zellbiologen verlassen sich auf diese Technik, um Zelltod zu untersuchen, warum nicht wir einige seiner Anwendungen überprüfen.
Mit diesem Verfahren können Wissenschaftler verfolgen welche intrazelluläre Proteine bei der Apoptose beteiligt sind. In diesem Video haben die Forscher die Wirkung von Cisplatin, eine Anti-Krebs-Medikament, auf normal Nierenzellen zu sehen, ob es Apoptose induziert analysiert. Eine Gruppe von Zellen um eine aktive Form der das Enzym Proteinkinase C oder PKC overexpress ausgestrahlt wurde, und die andere Gruppe wurde mit einer nicht-funktionale Form ausgestrahlt – dominant negativen PKC. Zellen mit dem Ausdruck PKC und mit Cisplatin behandelt unterzog sich Apoptose im Laufe der Zeit, aber mit dem Ausdruck der inaktiven dominant negativen PKC Zellen waren resistent gegen Apoptose, darauf hinweist, dass das Enzym ein wichtiger Akteur in der Cisplatin-induzierten Apoptose-Signalweg ist.
Forscher verwenden auch diese Flecken der zytotoxische Potenzial der spezifischen T-Zellen zu testen. Zytotoxischen T-Zellen können bestimmte Membranproteine auf die Zielzelle zu erkennen und seinen Tod auf Bindung an es zu induzieren. Hier Forscher Antigen-spezifische T-Zellen mit Ziel Tumorzellen und annexin V, inkubiert und dann beobachtet Induktion der Tumor Zelle Apoptose durch T-Zell-Engagement. Flow Cytometry Daten offenbart den Prozentsatz der Ziel Zelltod in an- und Abwesenheit von zytotoxischen T-Zellen.
Zu guter Letzt verwenden Wissenschaftler diese Methode, um Zellviabilität nach gen Lieferung zu bewerten. In diesem Fall wollten Forscher Zelle Überleben nach Nucleofection zu beurteilen – eine Methode, die eine Kombination von Chemikalien und einem angewandten elektrischen Feld verwendet, um vorübergehende erstellen Poren in zellulären und nukleare Membranen, wodurch gen Lieferung. Mithilfe von annexin V plus ein Farbstoff namens 7-Aminoactinomycin D oder 7-AAD, die, ähnlich wie PI an DNA bindet, sie zeigten, dass Nucleofection verursacht geringe Zelltod durch Apoptose oder Nekrose.
Sie haben nur Jupiters Video auf annexin V und PI Kennzeichnung angesehen. In diesem Video wir kurz diskutiert die charakteristischen Merkmale der Apoptose und nekrotischen Zellen, überprüft die Prinzipien, die hinter dieser Methode, beobachtete eine verallgemeinerte Verfahren dafür häufig benutzte Technik, und einige Anwendungen in der Vorschau angezeigt. Angesichts der Bedeutung zu verstehen, wie verschiedene Zellen dient sterben unter verschiedenen Bedingungen, annexin V und PI Kennzeichnung als ein wichtiges Instrument für Zellbiologen dieses Phänomen interessiert. Wie immer vielen Dank für das ansehen!
