Esta investigación fue apoyada por el fondo científico médico del alcalde de la ciudad de Viena y la Österreichische Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y uso de la Universidad médica de Viena y llevó a cabo según la Federación de europeo laboratorio animales ciencia asociaciones (personal). Tenga en cuenta que todos los procedimientos descritos en este protocolo sólo deben realizarse después de la aprobación institucional y gubernamental, así como por el personal que es técnicamente competente.
1. HFD-alimentó ratones
Nota: Mantenga todos los ratones C57BL/6J en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con libre acceso a alimentos y agua.
<ol><li>En 6 semanas de edad, lugar de ratones para 8-12 semanas en un HFD (40-60% calorías de grasa) para inducir a la obesidad, mientras se alimenta el magro grupo de control una dieta baja en grasa (LFD) (10% calorías de grasa).</li>
	<li>Determinar el peso corporal de los ratones sobre una base semanal. Las curvas de peso deben muestran patrones similares en ambos grupos, con una pendiente mayor en el grupo HFD-alimentó.</li>
</ol>2. USA
Nota: Si los puntos de tiempo de muestreo de sangre son elegidos durante OGTT cada 15 min, el experimento debe realizarse con un máximo de 15 ratones en paralelo, para tener al menos 1 minuto de tiempo de manipulación por ratón.
<ol><li>Preparativos en la víspera OGTT<ol>
<li>Transferir a los ratones en una jaula con ropa de cama fresca y rápida que durante la noche antes de la prueba (14 h), asegurando que los ratones tengan acceso a agua potable (por ejemplo, retirar los alimentos en 18:00 para un tiempo de inicio en la mañana siguiente a las 8:00). Nota: Ratones de ayuno durante la noche es el acercamiento estándar, sin embargo un ayuno corto (5-6 h) es más fisiológico para los ratones (véase la discusión para más detalles).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparaciones en el día del experimento (pero antes del experimento)<ol>
<li>Preparar 10 mL de solución glucosa al 20% (disolver D-(+)-glucosa en agua destilada). Nota: Todos los reactivos que se administran a los animales deben ser grado farmacológico y estéril.</li>
		<li>Preparar una placa de 96 pocillos para colección de plasma, llenando un pozo para cada punto del tiempo de muestreo y cada ratón con 5 μl NaEDTA (0,5 M de EDTA, pH 8.0 en 0.9% NaCl, almacenamiento a temperatura ambiente). Durante el experimento, guarde esta placa de hielo. Nota: Ver complementarios figura 1 para una lista detallada.</li>
	</ol></li>
	<li>Medir el peso corporal de todos los ratones y su cola la marca con un rotulador permanente para hacer los ratones fácilmente reconocibles (por ejemplo, dash de ratón 1 = 1, guiones de ratón 2 = 2, etc.).</li>
	<li>Medición de glucosa y tomar muestras de sangre (figura 2)<ol>
<li>Cuidadosamente corte 1-2 mm de la punta de la cola con unas tijeras afiladas ("variante A" en la figura 2). Siempre limpie la primera gota de sangre para evitar la hemólisis o contaminación con fluido de tejido antes de tomar muestras de sangre para determinación de glucosa de la sangre. Extraer una pequeña muestra de sangre (aproximadamente 3 μL) para medir el nivel de glucosa en sangre basal (= momento 0) con el glucómetro. PRECAUCIÓN: Compruebe y ajuste la cantidad de carga de las tiras reactivas en un glucómetro. Nota: Como un método de muestreo alternativo sangre, nick la vena lateral de la cola de un ratón con una hoja de bisturí afilado ("variante B" en la figura 2). La vena lateral de la cola se accede generalmente a aproximadamente un tercio a lo largo de la longitud de la cola de la punta de la cola, moviéndose hacia la base de la cola para muestras múltiples. Se recomienda el uso de una crema de anestesia local. Detener el flujo de sangre aplicando presión con el dedo sobre el tejido blando de al menos 30 s antes de regresa el animal a su jaula.</li>
		<li>Recoger una muestra de sangre (alrededor de 30 μL) mediante un tubo capilar fresco (mantener la horizontal del tubo capilar). Vacíe el tubo capilar mediante una pipeta poniendo la punta de la pipeta en la parte superior del extremo del tubo capilar y con cuidado empujar la sangre recogida en un pocillo de la placa de 96 pocillos, evitando burbujas de aire. Repita este procedimiento para todos los ratones - uno a la vez. Nota: Como alternativa para recolección de sangre a través de un tubo capilar, utilice una pipeta ajustada al volumen correcto (por ejemplo, 30 μL) para recoger la sangre, o recoger una gota de sangre de la cola en la película de parafina y pipeta lo en la solución de EDTA. Estrictamente evitar el contacto de la jalea de petróleo con sangre o glucómetro Optium, como pueden influir en las mediciones sucesivas de glucosa e insulina. PRECAUCIÓN: La OGTT es muy estresante para los ratones: ratones magras pueden perder alrededor de 15% de su peso corporal durante un ayuno nocturno. Además, la muestra de sangre en diferentes puntos temporales conduce a una pérdida considerable de sangre. Para el muestreo de sangre más fácil, es posible Masajear cuidadosamente la mouse-tail con vaselina. Nota: Las directrices pueden limitar la cantidad permisible de sangre recogido dentro de un período determinado. Los volúmenes de muestreo y puntos de tiempo deben ajustarse para no exceder los máximos permitidos. El peso corporal de los ratones pueden usarse para calcular el total retiro permitido de la sangre.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcular el volumen requerido de solución de glucosa basada en peso corporal (1 g glucosa/kg de peso corporal, esta puede incrementarse hasta 3 g/kg) al ser administrado por sonda oral para cada ratón. Por ejemplo, un ratón con un peso de 30 g tendría 150 μL de una solución de glucosa 20% administrar 30 mg de glucosa. Nota: A la base de la dosis de glucosa en el peso del ratón es el procedimiento estándar. Si se dispone de datos de la composición corporal, la dosis de glucosa OGTT debe ser calculado basado en la magra masa corporal (ver la discusión para más detalles).</li>
	<li>Administración de glucosa<ol>
<li>Preparación de everythingthat es necesario durante el experimento entero por adelantado (temporizador, hoja de registro del experimento, glucosa monitor y tiras, tubos capilares, jeringas, solución de glucosa, placa de 96 pocillos, bisturí, calculadora, balanza, marcador permanente, papeles de banco, una pipeta con una punta y guantes).</li>
		<li>Para el uso de glucosa, refrena el ratón agarrando firmemente por el pescuezo. Aplique suficiente firmeza a la piel alrededor del cuello para evitar que el ratón de una torsión de la refrena y correctamente incline su cabeza hacia atrás. También asegúrese de que el ratón pueda respirar correctamente. Nota: Una vez iniciada la administración de glucosa, administración del tiempo es muy importante.</li>
		<li>Administrar con cuidado la solución de glucosa (basada en paso 2.5) directamente en el estómago con una aguja de alimentación. Directo con cuidado la aguja de alimentación a través de la boca hacia el esófago. Permitir que el ratón para tragar la aguja: la aguja se hunde totalmente en la parte inferior del esófago/estómago del ratón. Luego inyectar la solución de glucosa (figura 3a).<ol>
<li>Si encuentra alguna resistencia, o si el animal lucha inmediatamente, retire la aguja y vuelva a colocarlo. Iniciar el temporizador inmediatamente después de la primera sonda nasogástrica y administrar glucosa a otros ratones en intervalos de 1 minuto. Nota: Puede ser útil aplicar una gota de solución de glucosa directamente de la alimentación de la aguja a la boca del ratón, que estimulará la lamer y tragar, facilitando así el facilitar la inserción de la aguja de alimentación. No aplique presión al insertar la aguja de alimentación como esto puede dañar seriamente el animal.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Después de 15 minutos, medir niveles de glucosa en sangre con el glucómetro y además tomar muestras de sangre (30 μL) (como se describe en detalle en el paso 2.4) de cada ratón en el mismo orden como fueron inyectados. Nota: La gestión del tiempo es muy importante; seguir tan de cerca como sea posible utilizando los mismos intervalos de tiempo en cuanto a la sonda nasogástrica. Que los ratones mover tan libremente como sea posible y el límite de restricción al mínimo durante todo el procedimiento para reducir el estrés, que puede modificar los resultados. Leche la cola con una mano y recoger la sangre con la otra.</li>
	<li>Repita el paso 2.7 en momentos seleccionados dependiendo de los resultados esperados (p. ej., a 30, 45, 60, 90, 120, 150 y 180 min después de la administración de glucosa). Si los puntos de tiempo son más de 120 min, asegúrese de que los ratones tengan acceso a agua potable. Asegúrese de que los ratones tengan siempre acceso a agua potable. Cuando haya terminado el experimento, retomar los ratones sus jaulas hogar equipados con alimentos y agua. PRECAUCIÓN: La OGTT es muy agotador para los ratones. Por lo tanto, esperar al menos 1 semana antes de realizar la siguiente prueba metabólica, como un ITT.</li>
	<li>Después del experimento, centrifugar las muestras de sangre a 2.500 x g, 30 min, 4 ° C. Transferir el sobrenadante (plasma) para vaciar los pozos de la placa y almacenarlo a-20 ° C hasta su análisis.<ol>
<li>Grabar la hemólisis de las muestras si está presente (ver sección 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Determinar los niveles de la insulina del plasma utilizando un ELISA disponible comercialmente kit (véase la Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante del kit. Nota: Dependiendo del estado de ayuno, así como en el metabolismo de los ratones investigados, pueden surgir dificultades durante este análisis: los niveles de insulina de ayuno durante la noche (momento 0) son muy bajos y por lo tanto cerca del límite de detección. Para evitar este problema, doblar la cantidad de volumen plasmático recomendada y por consiguiente reducir el resultado de la prueba de ELISA. Por otro lado, si ratones alcanzan el pico de insulina durante OGTT, especialmente en los ratones alimentados de HFD, los niveles de insulina pueden exceder el límite de detección: diluir la muestra (por ejemplo, 10 veces con 0.9% NaCl) y repetir el ensayo de ELISA. Hemólisis en muestras de plasma puede conducir a la degradación de la insulina, resultando en una disminución de los valores de lectura. La degradación depende de tiempo, la temperatura y la concentración de hemoglobina en la muestra. Siempre mantenga las muestras hemolizadas fría o con hielo para reducir la degradación de insulina.</li>
</ol>3. ITT
Nota: Las mismas precauciones descritas para OGTT (manejo de ratones, sangre, glucómetro y uso de la jalea de petróleo) también deban aplicarse cuando se realiza la ITT. Por ejemplo, todas las inyecciones deben llevarse a cabo dentro de 15 min en intervalos de 1 minuto si 15 ratones son probados en paralelo. Para la ITT, la posterior recogida de muestras de sangre con tubos capilares es opcional.
<ol><li>Preparativos antes del experimento<ol>
<li>Ayunar a ratones durante al menos 2 h antes de la inyección de insulina, asegurando que los ratones tengan acceso a agua potable (por ejemplo, eliminar alimentos en 8:00, ratones de prueba 2-5 h más tarde).</li>
		<li>Diluir 1:1,000 de insulina en 0.9% NaCl (Stock: 100 insulina U/mL; trabajo concentración 0.1 U/mL) y preparar 20% glucosa (D-(+)-solución de glucosa disuelta en agua destilada) administrará si los ratones llegan a ser hipoglucémicos. Nota: La ITT se realiza generalmente después de un corto ayuno para evitar la hipoglucemia que puede ocurrir lo contrario en la noche los animales en ayunas. Todos los reactivos que se administran a los animales deben ser grado farmacológico y estéril.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir el peso corporal de los ratones, marcar la cola, cortar la punta de la cola con unas tijeras afiladas y medir niveles de glucosa en sangre basal como se describe anteriormente para el SOG en el paso 2.4.</li>
	<li>Inyección de insulina<ol>
<li>Para inyectar insulina intraperitoneal (0,75 U insulina/kg de peso corporal, calculada previamente), refrenar el ratón por el método de pescuezo.</li>
		<li>Utilizar un estilo fresco, estéril 27 o 30 calibre aguja para cada animal evitar la incomodidad y el riesgo de infección de cualquier sitio de la inyección. Nota: La esterilización de la piel puede prolongar la duración de la administración de insulina y así puede causar disturbios adicionales al animal. Por lo tanto, no se recomienda.</li>
		<li>Incline la cabeza de ratón hacia abajo en un ángulo ligero para exponer el lado ventral del animal. Coloque la aguja con el bisel hacia arriba y un ángulo de 30 ° en el cuadrante inferior derecho del abdomen del animal (figura 3b). Iniciar el temporizador inmediatamente después de inyecta el primer ratón. Nota: Servicio de dosis bajas (0.1 U/kg) puede realizarse para evaluar específicamente la sensibilidad a la insulina hepática. En cuanto a la OGTT, calcular el volumen de inyección basado en el peso corporal es el procedimiento estándar, basándose en la dosis en corporal magra masa es preferible si se dispone de datos de la composición corporal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Los niveles de glucosa en la sangre medida en puntos de tiempo seleccionado (por ejemplo, después de 15, 30, 45, 60 y 90 min). Nota: Como la insulina tiene un corto tiempo de ~ 10 min en ratones13, diferencias finales después de la administración de insulina (p. ej., después de 2 h) no pueden reflejar un efecto directo de la acción de la insulina. Administrar solución glucosa al 20% en caso de un ratón hipoglicémico (niveles por debajo de 35 mg/dL de glucosa en la sangre) y está en riesgo de morir.</li>
	<li>Después de la última vez puntos, coloque los ratones en sus jaulas hogar preparados con un montón de comida y agua.</li>
</ol>

<ol>
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A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+mice.">Intraperitoneal injection of mice.</a> Appl Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).</li><li>Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+glucose+homeostasis.">Evaluation of glucose homeostasis.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter. , 23 (2007).</li><li>Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+for+assessing+insulin+sensitivity+and+resistance+in+vivo:+advantages,+limitations,+and+appropriate+usage.">Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (1), E15-E26 (2008).</li><li>McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+experiment+in+centralized+mouse+phenotyping:+the+Vanderbilt+experience+and+recommendations+for+evaluating+glucose+homeostasis+in+the+mouse.">NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).</li><li>Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+models+for+metabolic+assessment+in+mice.">Methods and models for metabolic assessment in mice.</a> J Diabetes Res. 2013, 986906 (2013).</li><li>Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-peptide+as+a+measure+of+the+secretion+and+hepatic+extraction+of+insulin.+Pitfalls+and+limitations.">C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations.</a> Diabetes. 33 (5), 486-494 (1984).</li><li>Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+assessing+determinants+of+glucose+homeostasis+in+the+conscious+mouse.">Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse.</a> Mamm Genome. 25 (9-10), 522-538 (2014).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con la alta prevalencia de diabetes y enfermedades asociadas en la población mundial, hay una necesidad para la investigación abordando el mecanismo molecular, prevención y tratamiento de la enfermedad19. El protocolo presentado describe métodos bien establecidos para la generación de ratones HFD, un robusto modelo animal utilizado para la investigación metabólica, así como la conducción de la OGTT y ITT, que son potentes herramientas para la evaluación de las alteraciones metabólicas d...

En los países desarrollados, la obesidad y la diabetes alcanzaron dimensiones epidémicas debido a la inactividad física y el consumo excesivo de alimentos procesados, efectos que son conducidos por la rápida urbanización, industrialización y globalización. Aunque investigación en resistencia a la insulina y sus comorbilidades, tales como hiperlipidemia y aterosclerosis, ha ganado importancia en las últimas décadas, los complejos mecanismos biológicos que regulan el metabolismo en la salud y la enfermedad siguen siendo incompleto entendido y todavía hay una necesidad urgente de nuevas modalidades de tratamiento prevenir y tratar estas enfermedades1.
Insulina y sus hormonas contador-reguladoras glucagón sirven como los principales reguladores del equilibrio oferta y macronutrientes energía celular, manteniendo así también sangre sistémica adecuada glucosa concentraciones2. Glucosa sí mismo actúa como uno de los principales estimuladores de la secreción de insulina por células β pancreáticas, mientras que otros macronutrientes, factores humorales como entrada neural más modificar esta respuesta. Insulina, en consecuencia, desencadena los procesos anabólicos del estado fed facilitando la difusión de glucosa en la sangre de exceso en la músculo y células gordas y además activando la glucólisis así como proteínas o síntesis de ácidos grasos, respectivamente. Además, insulina suprime la salida de glucosa hepática inhibiendo la gluconeogénesis. Consumo de energía de exceso crónico y meta-inflamación conducen a hiperinsulinemia y resistencia a la insulina periférica debido a la abajo-regulación de la expresión del receptor de insulina, así como alteraciones en las vías de señalización aguas abajo, lo que resulta en deterioro sensibilidad a la disposición de glucosa mediada por insulina, así como inhibición insuficiente de la glucosa hepática producción3,4,5,6.
Una amplia gama de modelos animales con inducción genética, nutricional o experimental de la enfermedad han demostrado para ser excelentes herramientas para el estudio de los mecanismos moleculares de resistencia a la insulina y varias formas de diabetes, así como sus enfermedades acompañantes7 . Un ejemplo es el modelo de ratón inducido por HFD ampliamente utilizado y bien establecida, que se caracteriza por el rápido aumento de peso debido al aumento de la ingesta dietético en combinación con la menor eficiencia metabólica, resultando en resistencia de insulina8, 9. tanto en modelos animales y humanos, una elevación en sangre glucosa y la insulina niveles en ayunas, así como una tolerancia deteriorada a la administración de glucosa son utilizados indicadores de resistencia a la insulina y otras alteraciones sistémicas de la glucosa metabolismo. Monitoreo glucosa e insulina niveles de sangre en el estado basal o tras estímulo son lecturas de fácil acceso.
El presente Protocolo describe la generación de ratones alimentados con HFD como dos métodos utilizados, la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) y la prueba de resistencia de insulina (ITT), que son útiles para caracterizar el fenotipo metabólico e investigar alteraciones en el metabolismo de la glucosa. Describimos la OGTT detalladamente, que evalúa la eliminación de una secreción de insulina y carga de glucosa por vía oral con el tiempo. Además, ofrecemos instrucciones sobre cómo llevar a cabo la ITT para investigar la acción de la insulina corporal total mediante el control de la concentración de la glucosa de la sangre en respuesta a un bolo de insulina. Los protocolos descritos en este artículo están bien establecidos y se han utilizado en múltiples estudios10,11,12. Además de ligeras modificaciones que pueden ayudar a incrementar el éxito, les da las pautas para el diseño experimental y análisis de datos, así como consejos útiles evitar peligros potenciales. Los protocolos descritos pueden ser herramientas muy poderosas para investigar la influencia de la genéticas, farmacológicos, dieta y otros factores ambientales sobre el metabolismo de la glucosa de todo el cuerpo y sus enfermedades asociadas como resistencia a la insulina. Además de la estimulación con glucosa o insulina, puede utilizarse una variedad de otros compuestos para la estimulación según el propósito de la investigación individual. Aunque fuera del alcance de este manuscrito, muchas otras aplicaciones posteriores pueden realizarse en las muestras de sangre dibujada, como el análisis de sangre valores distintos de la glucosa y la insulina (p. ej., lípidos y lipoproteínas perfiles) así como toda Análisis de marcadores metabólicos (p. ej., reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real, análisis de Western blot y análisis genitals del Immunosorbent (ELISA)). Citometría de flujo más y fluorescencia activada célula clasificación (FACS) puede aplicarse para investigar los efectos en las poblaciones de la célula distinta, mientras que transcriptómicos, proteómicos y metabolómicos enfoques también pueden ser utilizados para el análisis no focalizados.
En general, proporcionamos un protocolo simple para generar un modelo de ratón inducido por HFD, mientras más describir dos enfoques de gran alcance para estudiar alteraciones metabólicas de todo el cuerpo, la usa y la ITT, que puede ser herramientas útiles para el estudio de la patogénesis de la enfermedad y el desarrollo de nuevas terapias, especialmente en el campo de enfermedades asociadas por el metabolismo como la resistencia a la insulina y diabetes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse strain: C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>LFD/HFD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Chek Performa - Glucometer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6870228</td>
			<td>OGTT/ITT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Chek Performa - Strips</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6454038</td>
			<td>OGTT/ITT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td>OGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actrapid - Insulin</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td>417642</td>
			<td>ITT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable Feeding Needles</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#18061-22</td>
			<td>OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix-Fine dosing syringes</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>OGTT/ITT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Insulin needle (30G x 1/3&#34;; &#248; 0.30 x 13 mm)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>304000</td>
			<td>ITT; lean mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican (G 27 x 3/4&#34;; &#248; 0.40 x 20 mm)&#160;&#160;</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657705</td>
			<td>ITT; mice on HFD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td>SP0016</td>
			<td>OGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit</td>
			<td>Crystam Chem</td>
			<td>90080</td>
			<td>OGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Diet with 60% kcal% fat</td>
			<td>Research Diets Inc</td>
			<td>D12492</td>
			<td>mice on HFD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Diet with 10% kcal% fat.</td>
			<td>Research Diets Inc</td>
			<td>D12450B</td>
			<td>mice on LFD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND micro haematocrit capillary</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR749321</td>
			<td>OGTT/ITT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline - creme</td>
			<td>Riviera</td>
			<td>P1768677</td>
			<td>OGTT/ITT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of in vivo glucose metabolism in high-fat diet-fed mice using oral glucose tolerance test (ogtt) and insulin tolerance test (itt)

La obesidad representa el más importante factor de riesgo en la patogenia de la diabetes tipo 2, una enfermedad que se caracteriza por una resistencia a la captación de glucosa estimulada por insulina y una descompensación grave del metabolismo de la glucosa sistémica. A pesar de progresos considerables en la comprensión del metabolismo de la glucosa, los mecanismos moleculares de la regulación en salud y la enfermedad siguen bajo investigación, mientras que se necesitan urgentemente nuevos enfoques para prevenir y tratar la diabetes. Dieta derivada de la glucosa estimula la secreción pancreática de insulina, que sirve como el principal regulador de los procesos anabólicos celulares durante el estado de alimentación y así equilibra la glucosa en la sangre los niveles para mantener la condición de energía sistémica. Sobrealimentación disparadores meta-inflamación crónica, que conduce a alteraciones en la insulina periférica asociado a receptor de señalización y por lo tanto reduce la sensibilidad a la disposición de glucosa mediada por insulina. Estos eventos resultan en elevados de glucosa en ayunas y los niveles de insulina así como una reducción en la tolerancia a la glucosa, que a su vez sirven como indicadores importantes de resistencia a la insulina. Aquí, presentamos un protocolo para la generación y caracterización metabólica de la dieta alta en grasas (HFD)-alimentó ratones como modelo frecuente de resistencia a la insulina inducida por la dieta. Ilustramos detalladamente la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT), que supervisa la disposición periférica de una secreción de insulina y carga de glucosa por vía oral con el tiempo. Además, presentamos un protocolo para la prueba de tolerancia a insulina (ITT) supervisar la acción de la insulina de todo el cuerpo. Estos métodos y sus aplicaciones posteriores constituyen herramientas poderosas para caracterizar el fenotipo metabólico general de ratones, así como para evaluar específicamente alteraciones en el metabolismo de la glucosa. Pueden ser especialmente útiles en el campo de investigación amplio de resistencia a la insulina, diabetes y obesidad para proporcionar una mejor comprensión de la patogenia, así como para probar los efectos de las intervenciones terapéuticas.

La figura 1 muestra un esquema horario para fenotipado metabólico de ratones con una dieta. En una edad de aproximadamente 6 semanas, los ratones deben colocarse en un HFD, mientras que un grupo de LFD puede servir como el grupo de control. Lo importante, peso corporal deberá determinarse semanalmente para observar si hay un aumento esperado en el peso corporal. Cualquier tipo de estrés (p. ej., ruido o comportamiento agresivo del macho) puede int...

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Estudio del metabolismo de la glucosa in vivo en ratones alimentados con una dieta rica en grasas mediante la prueba de tolerancia oral a la glucosa OGTT y la prueba de tolerancia a la insulina ITT | Medicina | Video

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

Estudio In Vivo del metabolismo de glucosa en ratones alimentados con dieta alta en grasas mediante prueba de tolerancia a la glucosa Oral (OGTT) y prueba de tolerancia a insulina (ITT)

El actual artículo describe la generación y caracterización metabólica de ratones alimentados con dieta alta en grasas como un modelo de resistencia a la insulina inducida por la dieta y la obesidad. Además cuenta con protocolos detallados para realizar la prueba de tolerancia oral a la glucosa y la prueba de tolerancia a insulina, monitoreo de todo el cuerpo alteraciones del metabolismo de la glucosa en vivo.

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

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Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

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67.3K vistas.  Medical University of Vienna. El actual artículo describe la generación y caracterización metabólica de ratones alimentados con dieta alta en grasas como un modelo de resistencia a la insulina inducida por la dieta y la obesidad. Además cuenta con protocolos detallados para realizar la prueba de tolerancia oral a la glucosa y la prueba de tolerancia a insulina, monitoreo de todo el cuerpo alteraciones del metabolismo de la glucosa en vivo.

Video: Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

Making Sense of Listening: The IMAP Test Battery

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the abilities to extract and use the information encoded in the auditory signal. We refer to these as listening skills (or auditory processing AP). Deficits in these skills are associated with delayed language and literacy development, though the nature of the relevant deficits and their causal connection with these delays is hotly debated.
When a child is referred to a health professional with normal hearing and unexplained difficulties in listening, or associated delays in language or literacy development, they should ideally be assessed with a combination of psychoacoustic (AP) tests, suitable for children and for use in a clinic, together with cognitive tests to measure attention, working memory, IQ, and language skills. Such a detailed examination needs to be relatively short and within the technical capability of any suitably qualified professional. Current tests for the presence of AP deficits tend to be poorly constructed and inadequately validated within the normal population. They have little or no reference to the presenting symptoms of the child, and typically include a linguistic component. Poor performance may thus reflect problems with language rather than with AP. To assist in the assessment of children with listening difficulties, pediatric audiologists need a single, standardized child-appropriate test battery based on the use of language-free stimuli.
We present the IMAP test battery which was developed at the MRC Institute of Hearing Research to supplement tests currently used to investigate cases of suspected AP deficits. IMAP assesses a range of relevant auditory and cognitive skills and takes about one hour to complete. It has been standardized in 1500 normally-hearing children from across the UK, aged 6-11 years. Since its development, it has been successfully used in a number of large scale studies both in the UK and the USA. IMAP provides measures for separating out sensory from cognitive contributions to hearing. It further limits confounds due to procedural effects by presenting tests in a child-friendly game-format. Stimulus-generation, management of test protocols and control of test presentation is mediated by the IHR-STAR software platform. This provides a standardized methodology for a range of applications and ensures replicable procedures across testers. IHR-STAR provides a flexible, user-programmable environment that currently has additional applications for hearing screening, mapping cochlear implant electrodes, and academic research or teaching.

A test battery (IMAP) for performing an in-depth assessment of auditory and cognitive abilities contributing to listening skills is described. It is quick to administer, child-friendly and free from linguistic confounds. Stimulus generation and protocol management are controlled via a software platform (IHR-STAR) to ensure replicable procedures.

Tener sentido de la escucha: la batería de pruebas IMAP

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the ...

Investigación

Medicina

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time and temperature restrictions, technical sophistication, and cost of reagents, in particular monoclonal antibodies to measure CD4 on blood cells, the only currently acceptable method. A commonly used cost-saving and time-saving laboratory strategy is to calculate, rather than measure certain blood values. For example, LDL levels are calculated using the measured levels of total cholesterol, HDL, and triglycerides1. Thus, identification of cell-free correlates that directly regulate the number of CD4+ T cells could provide an accurate method for calculating CD4 counts due to the physiological relevance of the correlates.
The number of stem cells that enter blood and are destined to become circulating CD4+ T cells is determined by the chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 due to their influence on locomotion2. The process of stem cell locomotion into blood is additionally regulated by cell surface human leukocyte elastase (HLECS) and the HLECS-reactive active &alpha;1proteinase inhibitor (&alpha;1PI, &alpha;1antitrypsin, SerpinA1)3. In HIV-1 disease, &alpha;1PI is inactivated due to disease processes 4. In the early asymptomatic categories of HIV-1 disease, active &alpha;1PI was found to be below normal in 100% of untreated HIV-1 patients (median=12 &mu;M, and to achieve normal levels during the symptomatic categories4, 5. This pattern has been attributed to immune inactivation, not to insufficient synthesis, proteolytic inactivation, or oxygenation. We observed that in HIV-1 subjects with &gt;220 CD4 cells/&mu;l, CD4 counts were correlated with serum levels of active &alpha;1PI (r2=0.93, p&lt;0.0001, n=26) and inactive &alpha;1PI (r2=0.91, p&lt;0.0001, n=26) 5. Administration of &alpha;1PI to HIV-1 infected and uninfected subjects resulted in dramatic increases in CD4 counts suggesting &alpha;1PI participates in regulating the number of CD4+ T cells in blood 3.
With stimulation, whole saliva contains sufficient serous exudate (plasma containing proteinaceous material that passes through blood vessel walls into saliva) to allow measurement of active &alpha;1PI and the correlation of this measurement is evidence that it is an accurate method for calculating CD4 counts. Briefly, sialogogues such as chewing gum or citric acid stimulate the exudation of serum into whole mouth saliva. After stimulating serum exudation, the activity of serum &alpha;1PI in saliva is measured by its capacity to inhibit elastase activity. Porcine pancreatic elastase (PPE) is a readily available inexpensive source of elastase. PPE binds to &alpha;1PI forming a one-to-one complex that prevents PPE from cleaving its specific substrates, one of which is the colorimetric peptide, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA3NA). Incubating saliva with a saturating concentration of PPE for 10 min at room temperature allows the binding of PPE to all the active &alpha;1PI in saliva. The resulting inhibition of PPE by active &alpha;1PI can be measured by adding the PPE substrate SA3NA. (Figure 1). Although CD4 counts are measured in terms of blood volume (CD4 cells/&mu;l), the concentration of &alpha;1PI in saliva is related to the concentration of serum in saliva, not to volume of saliva since volume can vary considerably during the day and person to person6. However, virtually all the protein in saliva is due to serum content, and the protein content of saliva is measurable7. Thus, active &alpha;1PI in saliva is calculated as a ratio to saliva protein content and is termed the &alpha;1PI Index. Results presented herein demonstrate that the &alpha;1PI Index provides an accurate and precise physiologic method for calculating CD4 counts.

The &#945;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

A CD4 enumeration method, the &#x03B1;-test, is described which uses whole saliva to provide rapid and accurate CD4 counts. The &alpha;-test costs pennies and eliminates the need for technical training, costly reagents such as monoclonal antibodies, instrumentation, refrigeration, transport of samples, as well as collection and handling of blood.

El α-test: Rapid libre de células CD4 enumeración utilizando toda la saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the arteries (&beta;2). When systemically administered, it increases cardiac demand. Thus, dobutamine unmasks abnormal rhythm or ischemic areas potentially at risk of infarction. 
Monitoring of heart function during a cardiac stress test can be performed by either ecocardiography or cardiac catheterization. The latter is an invasive but more accurate and informative technique that the former.
Cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization accomplished as described here allows, in a single experiment, the measurement of the following hemodynamic parameters: heart rate (HR), systolic pressure, diastolic pressure, end-diastolic pressure, maximal positive pressure development (dP/dtmax) and maximal negative pressure development (dP/dtmin), at baseline conditions and under increasing doses of dobutamine.
As expected, in normal mice we observed a dobutamine dose-related increase in HR, dP/dtmax and dP/dtmin. Moreover, at the highest dose tested (12 ng/g/min) the cardiac decompensation of high fat diet-induced obese mice was unmasked.

We describe the protocol to perform a cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization in normal mice. Also we show its application to unmask subclinical cardiac disease in high fat diet-induced obese mice.

Prueba de esfuerzo cardíaco inducida por dobutamina y supervisado por cateterismo cardíaco en ratones

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Ensayo de prueba de permeabilidad Vasos Sanguíneos

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used techniques require killing of the animals and postmortem recovery of the meal1,2. This approach prevents longitudinal studies to determine changes in gastric emptying with age and progression of disease. The commonly used [13C]-octanoic acid breath test for humans3 has been modified for use in mice4-6 and rats7 and we previously showed that this test is reliable and responsive to changes in gastric emptying in response to drugs and during diabetic disease progression8. In this video presentation the principle and practical implementation of this modified test is explained. As in the previous study, NOD LtJ mice are used, a model of type 1 diabetes9. A proportion of these mice develop the symptoms of gastroparesis, a complication of diabetes characterized by delayed gastric emptying without mechanical obstruction of the stomach10.
This paper demonstrates how to train the mice for testing, how to prepare the test meal and obtain 4 hr gastric emptying data and how to analyze the obtained data. The carbon isotope analyzer used in the present study is suitable for the automatic sampling of the air samples from up to 12 mice at the same time. This technique allows the longitudinal follow-up of gastric emptying from larger groups of mice with diabetes or other long-standing diseases.

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Determination of gastric emptying with a non-invasive [13C]-octanoic acid breath test for tracking gastroparesis in female NOD LtJ mice.

Evaluación del vaciamiento gástrico en ratones diabéticos no obesos mediante un [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octanoico prueba del aliento ácido

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Characterization of Metabolic Status in Nonhuman Primates with the Intravenous Glucose Tolerance Test

The intravenous glucose tolerance test (IVGTT) plays a key role in the characterization of glucose homeostasis. When taken together with serum biochemical profiles, inclusive of blood glucose levels in both the fed and fasted state, HbA1c, insulin levels, clinical history of diet, body composition, and body weight status, an assessment of normal and abnormal glycemic control can be made. Interpretation of an IVGTT is done through measurement of changes in glucose and insulin levels over time in relation to the dextrose challenge. Critical components to be considered are: peak glucose and insulin levels reached in relation to T0 (end of glucose infusion), the glucose clearance rate K derived from the slope of rapid glucose clearance in the first 20 min (T1 to T20), the time to return to glucose baseline, and the area under the curve (AUC). These IVGTT measures will show characteristic changes as glucose homeostasis moves from a healthy to a diseased metabolic state5. Herein we will describe the characterization of nonhuman primates (Rhesus and Cynomolgus macaques), which are the most relevant animal model of Type II diabetes (T2D) in humans and the IVGTT and clinical profiles of these animals from a lean healthy, to obese dysmetabolic, and T2D state 8, 10, 11.

The goal of this protocol is to present a standard method to perform intravenous glucose tolerance tests (IVGTTs) to assess glycemic control in nonhuman primates and assess their metabolic status from healthy to dysmetabolic.

Caracterización del estado metabólico en primates no humanos con la prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa

The intravenous glucose tolerance test (IVGTT) plays a key role in the characterization of glucose homeostasis. When taken together with serum biochemical ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

El agotamiento de las células de ratón a partir de xenoinjertos de tumores humanos mejora significativamente análisis de aguas abajo de las células diana

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT

This paper describes the use of 18F-FDG and micro-PET/CT imaging to determine in vivo glucose metabolism kinetics in mice (and is transferable to rats). Impaired uptake and metabolism of glucose in multiple organ systems due to insulin resistance is a hallmark of type 2 diabetes. The ability of this technique to extract an image-derived input function from the vena cava using an iterative deconvolution method eliminates the requirement of the collection of arterial blood samples. Fitting of tissue and vena cava time activity curves to a two-tissue, three compartment model permits the estimation of kinetic micro-parameters related to the 18F-FDG uptake from the plasma to the intracellular space, the rate of transport from intracellular space to plasma and the rate of 18F-FDG phosphorylation. This methodology allows for multiple measures of glucose uptake and metabolism kinetics in the context of longitudinal studies and also provides insights into the efficacy of therapeutic interventions.

Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT

This study describes a protocol that uses 18F-FDG and positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) imaging, together with kinetic modelling, to quantify the in vivo, real-time uptake of 18F-FDG into tissues.

La determinación de metabolismo de la glucosa Kinetics Uso<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG Micro-PET / CT

This paper describes the use of 18F-FDG and micro-PET/CT imaging to determine in vivo glucose metabolism kinetics in mice (and is transferable to rats). ...

Improving Strength, Power, Muscle Aerobic Capacity, and Glucose Tolerance through Short-term Progressive Strength Training Among Elderly People

This protocol describes the simultaneous use of a broad span of methods to examine muscle aerobic capacity, glucose tolerance, strength, and power in elderly people performing short-term resistance training (RET). Supervised progressive resistance training for 1 h three times a week over 8 weeks was performed by RET participants (71&#177;1 years, range 65-80). Compared to a control group without training, the RET showed improvements on the measures used to indicate strength, power, glucose tolerance, and several parameters of muscle aerobic capacity. Strength training was performed in a gym with only robust fitness equipment. An isokinetic dynamometer for knee extensor strength permitted the measurement of concentric, eccentric, and static strength, which increased for the RET group (8-12% post- versus pre-test). The power (rate of force development, RFD) at the initial 0-30 ms also showed an increase for the RET group (52%). A glucose tolerance test with frequent blood glucose measurements showed improvements only for the RET group in terms of blood glucose values after 2 h (14%) and the area under the curve (21%). The blood lipid profile also improved (8%). From muscle biopsy samples prepared using histochemistry, the amount of fiber type IIa increased, and a trend towards a decrease in IIx in the RET group reflected a change to a more oxidative profile in terms of fiber composition. Western blot (to determine the protein content related to the signaling for muscle protein synthesis) showed a rise of 69% in both Akt and mTOR in the RET group; this also showed an increase in mitochondrial proteins for OXPHOS complex II and citrate synthase (both ~30%) and for complex IV (90%), in only the RET group. We demonstrate that this type of progressive resistance training offers various improvements (e.g., strength, power, aerobic capacity, glucose tolerance, and plasma lipid profile).

The effect of short-term resistance training on elderly people was investigated through the simultaneous use of several methods. Compared to a control group, many improvements were seen, including on muscle aerobic capacity, glucose tolerance, strength, power, and muscle quality (i.e., protein involved in cell signaling and muscle fiber type composition).

Mejora de la Fuerza, Potencia, Capacidad Aeróbica Muscular y Tolerancia a la Glucosa a través del Entrenamiento de Fuerza Progresiva a Corto Plazo entre Ancianos

This protocol describes the simultaneous use of a broad span of methods to examine muscle aerobic capacity, glucose tolerance, strength, and power in ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues contributes to type 2 diabetes mellitus (T2DM) development and appetite regulation in the hypothalamus. Chemokine CCL5 and C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) levels have been suggested to mediate arteriosclerosis and glucose intolerance in type 2 diabetes mellitus (T2DM). In addition, CCL5 plays a neuroendocrine role in the hypothalamus by regulating food intake and body temperature, thus, prompting us to investigate its function in hypothalamic insulin signaling and the regulation of peripheral glucose metabolism.
The micro-osmotic pump brain infusion system is a quick and precise way to manipulate CCL5 function and study its effect in the brain. It also provides a convenient alternative approach to generating a transgenic knockout animal. In this system, CCL5 signaling was blocked by intracerebroventricular (ICV) infusion of its antagonist, MetCCL5, using a micro-osmotic pump. The peripheral glucose metabolism and insulin responsiveness was detected by the Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Insulin signaling activity was then analyzed by protein blot from tissue samples derived from the animals.
After 7-14 days of MetCCL5 infusion, the glucose metabolism and insulin responsiveness was impaired in mice, as seen in the results of the OGTT and ITT. The IRS-1 serine302 phosphorylation was increased and the Akt activity was reduced in mice hypothalamic neurons following CCL5 inhibition. Altogether, our data suggest that blocking CCL5 in the mouse brain increases the phosphorylation of IRS-1 S302 and interrupts hypothalamic insulin signaling, leading to a decrease in insulin function in peripheral tissues as well as the impairment of glucose metabolism.

This protocol studies the role of chemokine (C-C motif) ligand 5 (CCL5) in the hypothalamus by delivering an antagonist, MetCCL5, into the mouse brain using a micro-osmotic pump brain infusion system. This transient inhibition of CCL5 activity interrupted hypothalamic insulin signaling, leading to glucose intolerance and peripheral systemic insulin sensitivity.

Estudio de la señal de insulina hipotalámica a la intolerancia de la glucosa periférica con un sistema de infusión continua de medicamentos en el cerebro de ratón

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Estudio In Vivo del metabolismo de glucosa en ratones alimentados con dieta alta en grasas mediante prueba de tolerancia a la glucosa Oral (OGTT) y prueba de tolerancia a insulina (ITT)

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