Nos gustaría agradecer a Julie Jarnigan, Meredith Owens, Rachel Hill, Brandon Moye, Laura Mafla, Olivia Fish y el resto del laboratorio de Reed por su ayuda con la cría de mosca y procesamiento de imágenes. Sean Méndez construyó la rueda original con la ayuda de la tienda de máquina de la UAB. Financiamiento para este estudio fue proporcionado por NIH R01 GM 098856 LKR y creatividad grado y Academia de investigación de la Universidad de Alabama a KEL y BJW.

1. rueda de configuración y operación
Nota: Ver figura 1 complementaria para esquemas en TW ejercicio de construcción de la máquina. Las piezas se enumeran en la Tabla de materiales. Las frases "TW", "Rueda", "máquina de ejercicio" y "la máquina" se usa indistintamente en el protocolo.
<ol><li>
Calibración del motor con interruptor de corriente tales que un período completo de rotación 15 s (4 rpm). Calibrar velocidad de rotación de la máquina antes de colocar la mosca viales en abrazaderas aseguradas atadas brazos giratorios.
	<ol>
<li>Ajustar la velocidad usando un cronómetro estándar y un objeto inmóvil temporalmente conectado a la máquina, como un pequeño pincel pegado a la tapa del motor con el pincel apenas tocando uno de los soportes giratorios. Tiempo el número de rotaciones en un minuto usando el objeto inmóvil como un punto de referencia y ajustar la velocidad para lograr un período rotatorio de s 15 (4 rpm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. mosca colección y mantenimiento
Nota: Todas moscas se mantienen en una incubadora de 25 ° C con 50% de humedad y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h entre manipulaciones del benchtop que se describe a continuación. Moscas son alimentadas con una dieta de laboratorio estándar de harina de maíz-melaza a menos que se indique lo contrario.
<ol><li>
Preparar la colocación de cámaras para cada genotipo de interés utilizando placas de agar jugo de manzana, una gota de levadura pasta por placa y 6 onzas, botellas de plástico para recoger los huevos que eclosionan en larvas.
	<ol>
<li>Para preparar jugo de manzana las placas de agar, llenar platos de Petri de 35 x 10 mm ¾-completo con agar al 3% disuelto en jugo de manzana comprada. Almacenar placas solidificadas en un refrigerador hasta su uso.</li>
		<li>En un tubo de centrífuga cónico de 50 mL, combinar comprada levadura seca activa con agua destilada en una proporción de 2 mL de agua por cada gramo de levadura. Mezcla la levadura con agua para crear una pasta con la consistencia de la salsa de tomate usando un vidrio varilla de agitación. Ajustar proporciones de levadura y agua según sea necesario para lograr la consistencia deseada.</li>
		<li>Guarde la pasta de levadura en el frigorífico entre aplicaciones. Mantenga la tapa del tubo floja para permitir que el gasear.</li>
		<li>Utilizar una aguja o cuchillo para perforar pequeños agujeros en 6 onzas botellas Plaza de fondo (polipropileno) como los orificios de ventilación de las cámaras de colocación.</li>
		<li>Frote una pequeña mancha de pasta de levadura (~ 3 mm de diámetro) en cada placa de agar jugo de manzana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lugar de moscas adultas del genotipo deseado en la botella de 6 oz y la botella de tapa con la placa de agar jugo de manzana. Fije la placa a la botella con bandas de goma. Invierta y coloque en una incubadora para permitir que los adultos ponen huevos.</li>
	<li>Cambiar las placas de agar jugo de manzana en una cámara de puesta dos veces al día (mañana y noche). Licencia utilizada placas en la incubadora para otro 12 – 24 h permitir que el primer instar las larvas al eclosionar.</li>
	<li>Recoger primero instar las larvas con un fino pincel o colección pick (aguja fina flexible unido a un mango). Lugar 50 primer instar larvas de un genotipo específico en un frasco de comida del tipo de comidas experimentales a desarrollar y metamorfosis completa, mientras que el ubicado en la incubadora (figura 2A).</li>
	<li>
Recoger a los adultos para el tratamiento de ejercicio (figura 2A).
	<ol>
<li>Pupación, recolectar pupas con un pincel pequeño y húmedo y colocar en frascos vacíos antes de la eclosión para evitar moscas adultas de exponerse a la dieta larvaria.</li>
		<li>Transferencia de moscas adultas a frascos de comida de dieta estándar de laboratorio como eclose. Uno a cinco días después de la eclosión, separar moscas basadas en el sexo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Designado mitad de los adultos recolectados cada a experimental y grupos de control. Mantener moscas en viales de dieta estándar de laboratorio a una concentración de 50 moscas por frasco.</li>
	<li>Transferencia de adultos a frascos de alimento fresco cada dos días para evitar quedarse atascados durante el ejercicio. Añadir varios granos de levadura vivo suplementario a la nueva comida inmediatamente antes de introducir las moscas. Nota: Si bien es posible mantener moscas sin un suplemento de levadura viva, hemos encontrado que las moscas adultas realizan mejor con la suplementación. La suplementación de levadura viva es una variable que podría ser modificada para adaptarse a objetivos experimentales del investigador.</li>
</ol>3. Protocolo del ejercicio
<ol><li>En el primer día del ejercicio (día 1), frasco de empuje tapones para dejar 1 cm de espacio en las ampollas de control y 6 cm de espacio entre la alimentación y el enchufe en viales de ejercicio (figura 1). Nota: Los frascos de control habrá un espacio limitado para moscas para moverse mientras que en la máquina de ejercicio y así vuela participarán en mucho menos movimiento que en ejercicio de viales.</li>
	<li>Colocar los frascos en las pinzas y luego darle las moscas 10 min para aclimatar en la máquina (figura 1B). Nota: Un control alternativo es mantener las moscas unexercised en la mesa adyacente a la máquina de ejercicio con 6 cm de espacio (en frasco) para mover normalmente. Se han encontrado11resultados similares de ejercicio en relación con el "1 cm en la rueda" y los controles "a 6 cm sobre la mesa".</li>
	<li>
Tratar tanto control y ejercicio vuela a la rotación de la máquina a temperatura constante durante 5 días consecutivos por semana con alternancia de períodos de rotación y el resto (figura 1D). Nota: Se necesita una temperatura constante para evitar los efectos de confusión de la temperatura en los niveles de actividad. Para estudios de manipulación de temperatura, coloque el TW dentro de una incubadora para modificar tratamientos de temperatura durante el entrenamiento.<ol>
<li>Funcionar la máquina de cuatro episodios de 15 minutos de ejercicio el día 1. Alternan estas peleas con períodos de descanso de 5 minutos.</li>
		<li>Cada uno de los siguientes días, añadir 5 minutos de ejercicio a uno de los episodios de ejercicio preexistente. Por ejemplo, el día 2, hacer el primer combate de ejercicio 20 minutos de largo, pero mantienen el resto de los combates a 15 minutos de largo.</li>
		<li>El día 3, ejercicio vuela durante 20 minutos durante los dos primeros episodios y 15 min para los siguientes dos episodios.</li>
		<li>En el día 4, 20 min de uso ejercicio peleas para todos excepto la pelea final, que debe ser sólo 15 minutos de largo.</li>
		<li>En el día 5, mantener todos los combates de ejercicio 20 minutos de largo. Nota: Durante los períodos de descanso, los frascos de las moscas deben permanecer firmemente afianzada con abrazadera en el TW. La orientación de los frascos durante estos períodos no es relevante porque la fuerza gravitacional experimentada por todas moscas provendrán de la misma dirección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de completar el ejercicio tratamiento para un día volver los alimentos vial tapones a sus posiciones normales y vuelta vuela sus incubadoras hasta el día siguiente.</li>
	<li>Después de la terminación del régimen de ejercicio completo, anestesiar a moscas utilizando métodos de anestesia estándar MOSCA CO2 . Entonces transferencia vuela a nuevos alimentos viales o tubos de microcentrífuga para la evaluación de características fenotípicas de interés. Nota: Fenotipos del ejemplo incluyen escalada capacidad (frasco de alimento), almacenamiento de triglicéridos (tubo de microcentrífuga) o expresión génica (tubo de microcentrífuga). El protocolo puede hacer una pausa aquí con las muestras almacenadas apropiadamente dependiendo de las evaluaciones a realizar. Ensayos, que estar moscas deberá realizarse puntualmente conforme a los objetivos específicos de la prueba fenotípica.</li>
</ol>4. evaluación de escalada
<ol><li>
Después de un día de descanso tras la finalización del Protocolo de ejercicio, prueba general mosca escalada desempeño usando una geotaxis negativa iterativo rápido (anillo)-como geotaxis negativa escalada ensayo22.
	<ol>
<li>Colocar grupos de 10 moscas en frascos vacíos con CO2 anestesia (o tapping directamente en frascos de comida si ya ordenados) y sellar con la película de parafina para evitar que las moscas escapan. Dar la vuela al menos 10 min para aclimatarse al nuevo vial. Para evitar que los frascos de vuelco, pegue un círculo de cartulina ~ 5 cm de diámetro en el fondo del frasco para proporcionar más superficie. Nota: Enchufes de Vial no deberían utilizarse porque impiden parte del frasco para determinar altura de escalado.</li>
		<li>Colocar frascos 20 cm delante de una cuadrícula de 1 cm x 1 cm a la vista de una cámara estacionaria montada con un contador de tiempo incorporado (un teléfono inteligente con un temporizador cámara aplicación funciona bien).</li>
		<li>Golpear los frascos suavemente el contador tres veces para golpear todas las moscas hasta el fondo del frasco. Después de golpear ligeramente el frasco por tercera vez, inmediatamente iniciar el temporizador de cámara de s 4 para capturar una imagen para determinar la altura ascendida por cada mosca. Nota: Tapping debe realizarse a una intensidad constante y por el mismo investigador en cada cambio de ejercicio de control para minimizar la variación en las respuestas de las moscas debido a golpecitos.</li>
		<li>Repita el paso 4.1.3 dos veces, con al menos 1 min descanso entre ensayos, para producir un total de tres pruebas por vial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Para conservar las moscas para otros análisis, inmediatamente después de finalizado el ensayo escalado, flash congele las moscas por inmersión en nitrógeno líquido.
	<ol>
<li>Puede utilizarse un matraz dewar poco profundas, abrir-rematado llenado de nitrógeno líquido a una profundidad de ~ 5 cm.</li>
		<li>Moscas de transferencia a tubos de microcentrífuga pequeña CO2 anestesia y luego colocar tubos en el frasco de dewar con nitrógeno líquido. Alternativamente, si futuros análisis requieren evitación de CO2, snap congelar las moscas directamente en sus viales escaladas golpeando suavemente vuela a la parte inferior de su frasco mientras que la parte inferior se sumerge en nitrógeno líquido y luego se transfieren las moscas congeladas a tubos de microcentrífuga con unas pinzas. Nota: Nitrógeno líquido es criogénico y debe usarse únicamente con ventilación adecuada de equipos y sala de protección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Process imágenes con la herramienta de selección de múltiples puntos de23 ImageJ.
	<ol>
<li>Abrir una imagen en la gestión de ImageJ.</li>
		<li>Establecer una escala de 1 cm en el papel de rejilla de fondo para calcular la distancia por cada mosca individual base. Utilice la "herramienta de línea" de la barra de herramientas a un lado del rastro de un cuadrado de 1 cm2 del papel de rejilla de fondo. Haga clic en la pestaña de "Analizar" y seleccione "Establecer escala". Ajuste la "distancia conocida" como '1.00' y «Unidad de longitud» como 'cm', asegúrese de que "Global" está desactivada y haga clic en "Aceptar".</li>
		<li>Seleccione el icono de "Selección de múltiples puntos" en la barra de herramientas y ampliar en la parte inferior de la cubeta en la imagen. Establecer el primer punto como la parte inferior del frasco haciendo clic en la parte inferior del frasco.</li>
		<li>Haga clic en el centro de cada mosca en el frasco para marcar como un punto de datos. Tenga en cuenta que hay un total de 11 puntos por vial, marcando la parte inferior de la cubeta y para cada vuelo.</li>
		<li>Haga clic en la pestaña de "Analizar" y seleccione "Medida" para generar una tabla de valores medidos. Guardar la tabla como un archivo csv.</li>
		<li>Abra el archivo csv en un programa de hoja de cálculo y calcular la distancia exacta subida por cada mosca restando los valores de los puntos 2-11 del punto 1 de la tabla de valores medidos.</li>
		<li>Repita los pasos del 4.3.1 a través 4.3.6 para cada imagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. triglicéridos almacenamiento ensayo
Nota: Las muestras, normas, solución estándar de glicerol y solución de trabajo de triglycerol utilizados en el ensayo se deben tener en el hielo para la duración del protocolo y deben almacenarse en el refrigerador cuando no esté en uso.
<ol><li>
Preparar estándares usando la solución estándar de glicerol.
	<ol>
<li>Hacer el espacio en blanco (B) agregando 1000 μl de buffer de homogenización a un tubo de microcentrífuga con la etiqueta B.</li>
		<li>Hacer estándar 1 (S1), 2,5 mg/mL por pozo, agregando 1000 μl de la solución estándar de glicerol a un tubo de microcentrífuga etiquetado S1.</li>
		<li>Hacer estándar 2 (S2), 1,25 mg/mL por pocillo, Añadir 500 μl de la solución estándar de glicerol a 500 μl del diH2O en un tubo de microcentrífuga etiquetado S2.</li>
		<li>Hacer estándar 3 (S3), 0,625 mg/mL por pozo, mediante la adición de 250 μl de la solución estándar de glicerol a 750 μl de diH2O en un tubo de microcentrífuga etiquetado S3.</li>
		<li>Hacer estándar 4 (S4), 0,3125 mg/mL por pozo, añadiendo 125 μl de la solución estándar de glicerol a 875 μl de diH20 en un tubo de microcentrífuga etiquetado S4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar solución de trabajo de triglycerol desde el Kit de determinación de triglicérido de suero.
	<ol>
<li>Añadir 40 mL de diH2O el reactivo de glicerol libre del kit y mezclar invirtiendo la botella.</li>
		<li>Añadir 10 mL de diH2O a la solución de triglicéridos del kit y mezclar invirtiendo la botella.</li>
		<li>Solución de reactivo y triglicéridos de glicerol de combinar y mezclar por inversión para preparar la solución de trabajo de triglycerol. Nota: La solución de trabajo de triglycerol es válida por 60 días y podrá realizar cuatro ensayos de placa de 96 pocillos por kit mediante el protocolo siguiente. Los volúmenes utilizados se redujo proporcionalmente del kit oficial de determinación de triglicérido de suero para su uso en el formato de la placa de 96 pocillos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verificar en blanco y estándares mediante pipeteo cuidadosamente 5 μl de cada norma en un plano de 96 pozos fondo claro microplacas en triplicado (o cuadruplicado para el espacio en blanco).
	<ol>
<li>Añadir exactamente 125 μl de solución de Triglycerol a cada bien que contenga un estándar. Permiten soluciones reaccionar durante 30 minutos.</li>
		<li>Coloque una placa de 96 pocillos en un espectrofotómetro y leer la absorbancia a 540 nm. Uso de las mediciones de absorbancia para crear una curva estándar y verificar la exactitud de las normas al evaluar el valor de R2 . Si R2 para los estándares es inferior a 0,98, volver a preparar más cuidadosamente las normas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Comenzar el día 1 del ensayo para triglicéridos almacenamiento14 usando tubos de microcentrífuga con 10 congelados moscas cada uno. Nota: Una pipeta de repetición o de varios canal no debe usarse nunca en este paso porque las cantidades de cada reactivo utilizado en el ensayo deben ser muy precisa y constante para obtener resultados reproducibles. En nuestra experiencia, pipetas de repetición y varios canales no tienen este grado de precisión y consistencia. Cada alícuota de una pipeta monocanal puede confirmarse visualmente por el experimentador para control de calidad y cualquier sesgos de específicos de pipeta monocanal serán experimentados por todas las muestras en el mismo grado.<ol>
<li>Preparar un stock de 200 mL de Buffer de homogenización mediante la combinación 0,272 g de KH2PO4, 400 μL de EDTA de 0,5 M y mL 199,6 de diH2O en una botella de vidrio.</li>
		<li>Añadir exactamente 100 μl de buffer de homogenización a cada uno de los 40 tubos de microcentrífuga con 10 adultos congelados después de la prueba de escalada. Luego, centrifugar las muestras durante 30 s a 18.000 g.</li>
		<li>Rutina de moscas utilizando un molino motorizado y maja (u otra forma de homogeneización de tejido) para preparar una solución lechosa. Asegúrese de que un mortero fresco se utiliza para cada muestra. Luego, centrifugar las muestras durante 2 min a 18.000 g.</li>
		<li>Pipetee sólo el top 75 μl de sobrenadante de cada tubo en nuevos tubos de microcentrífuga. Asegúrese de que ningún bit fly de la pelotilla es transferido a través. Colocar tubos de nuevo en el refrigerador durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Comenzar el día 2 del Protocolo de triglicéridos mediante la eliminación de las muestras del día 1 de la nevera. Nota: Paso 5.5 puede realizarse el mismo día que el 5.4 pero hemos encontrado la señal para la concentración de triglicéridos sea más robusto después de una noche en el refrigerador. Sin embargo, el tiempo entre los pasos 5.4 y 5.5 no debe exceder de 36 h.<ol>
<li>(Opcional) Vórtice del primer tubo con líquido sobrenadante para 10 s y pipeta de 5 μL en un tubo de microcentrífuga limpio. Agregar 95 μl de NaCl 0,15 M en el nuevo tubo de microcentrífuga. Almacenar estas submuestras en el congelador de-20 ° C para un posterior análisis de proteína si se desea. Nota: Estas muestras del sobrenadante con la solución de NaCl agregada pueden utilizarse para determinar el contenido de proteína usando análisis preferido del investigador. Utilizamos el método de Bradford24. El contenido de proteína es una forma de estandarizar la medida del contenido de triglicéridos, pero el investigador también debe ser cauteloso en la interpretación de esas relaciones desde ejercicio y dieta también puede afectar el almacenamiento de proteínas.</li>
		<li>Para los frascos originales de sobrenadante, vórtice del primer tubo con líquido sobrenadante por 10 s, después la pipeta de 5 μL en dos pocillos distintos de una microplaca de 96 pozos para producir técnicos Replica. Asegúrese de nota que pozos se utilizan para cada muestra. Repita este paso para los 39 tubos.</li>
		<li>Pipetear exactamente 5 μl del espacio en blanco en cuatro pozos de la microplaca, y para los pozos restantes, pipetear exactamente 5 μl de cada estándar por triplicado.</li>
		<li>Añadir solución de trabajo de triglycerol exactamente 125 μl a cada pocillo y deje que la solución reaccionar durante 30 minutos.</li>
		<li>Colocar la placa de 96 pocillos en un espectrofotómetro y leer la absorbancia a 540 nm.</li>
		<li>Convertir valores de absorbancia en concentración (mg/mL) usando la curva estándar calculada a partir de las normas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+complex+traits+using+the+Drosophila+Synthetic+Population+Resource.">Dissecting complex traits using the Drosophila Synthetic Population Resource.</a> Trends in Genetics. 30, 488-495 (2014).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo de ejercicio detallado aquí se ha demostrado para estimular con éxito el ejercicio suave en Drosophila y puede utilizarse para simular el ejercicio de resistencia en un laboratorio controlado ajuste11. Cabe señalar que inicialmente en el desarrollo del concepto de la rueda, se consideraron productos comerciales que pueden ser modificados para realizar del mismo modo (p. ej., un asador de laboratorio). Sin embargo, en última instancia, rechazamos este enfoque, elegir un diseño a la medida porque el equipo comercial no tenía suficientemente baja velocidad rotacional (rpm 4) y carecía de capacidad vial suficiente para la generación de alto rendimiento de muestra.
El propio protocolo TW puede ajustarse para abarcar una amplia gama de temas de investigación. Por ejemplo, ajuste de la frecuencia y duración de los regímenes de ejercicio de las moscas puede alterar las intensidades de los ejercicios que reciben. Al extender el protocolo más de una semana o a otros grupos de edad, es posible estudiar los efectos del ejercicio en el envejecimiento y diversas enfermedades relacionadas con la edad. Se recomienda que si se aplica un enfoque de ejercicio prolongado, entonces al menos un descanso a la semana debe añadirse para permitir la recuperación. Rendimiento y la mejora fue demostrado para ser mayor en los regímenes que incluyeron un día de recuperación que aquellos regímenes que utilizan consecutivo diario ejercicio12. También, advertimos contra ampliar la longitud de la pelea de ejercicio pasado 30 min desde habituación para el movimiento de rotación puede ocurrir después de largos períodos de continuo ejercen11. También hemos observado variaciones genéticas en la motivación de moscas para mantener sus niveles de actividad en el TW11. Así, si se desean más combates, considerar monitoreo de niveles de actividad de las moscas, presentada por Watanabe y enigma15,21 describe su modificación del concepto TW. Otros factores que podrían variar son temperatura y dormir-despierte los patrones, que se ha demostrado que también afectan los movimientos mosca26,27.
Hay una plétora de análisis disponibles durante y después de la terminación de protocolo para abordar los efectos del ejercicio en el nivel fisiológico, conductual y molecular, así como la posibilidad de desentrañar los efectos epigenéticos del ejercicio. Análisis metabólicos adicionales (p. ej., glucosa, glucógeno y proteínas), rendimiento cardiaco y respuesta inflamatoria medidas pueden utilizarse para profundizar en el ejercicio del efecto tiene en mosca cuerpo y fisiología composición12,14 ,24,28. Varios cambios de comportamiento asociados con la inducción de ejercicio, como cambios en el comportamiento, la actividad locomotriz y el sueño, la alimentación también pueden ser medidos utilizando herramientas como el CAFE ensayo29 actividad monitoreo dispositivos12,15 ,30. Cambios en la expresión génica y atribuido para el ejercicio de la respiración celular se pueden cuantificar utilizando métodos como qRT-PCR11 y respirometría31. Por último, Drosophila tienen valiosos recursos genéticos disponibles, tales como el Panel de referencia de Drosophila genética 2 y de los recursos de la población sintética de Drosophila que proporcionan a los investigadores la plataforma para realizar estudios genéticos cuantitativos25,32. Estas herramientas permiten experimentos de asignación, como asignación de estudios de Asociación de genoma completo y los Loci de rasgos cuantitativos, para identificar los loci candidatos asociados con dieta y ejercicio.
Estudios realizados utilizando la rueda demostraron que, en promedio, ejercicio disminuye el peso corporal, almacenamiento total de triglicéridos y glucógeno, contenido de proteína y rendimiento11de escalada. Además, hubo respuestas variables a ejercer a través de sexos y genotipos para peso corporal, así como los triglicéridos, proteínas, glucógeno, glucosa y actividad niveles11,15. Mientras que la variabilidad de la respuesta al ejercicio y la dieta a través de genotipos y el sexo puede ser difícil de interpretar y, a veces, contrario a la intuición, refleja las fuentes de variación real biológica observada en las poblaciones naturales. Nos esforzamos por entender la diversidad de factores subyacentes que contribuyen a los altos índices de MetS, herramientas que facilitan desenmarañar el papel relativo de los diversos factores que contribuyen analizando estos factores en organismos modelo será crucial para nuestra capacidad de desarrollar intervenciones de prevención y tratamiento personalizadas. Para evaluar plenamente la eficacia del ejercicio, cada uno de estos factores y cómo interactúan debe considerarse cuando la realización de experimentos y formular conclusiones.
El TW, como la mayoría de las otras máquinas mosca, está limitado en su capacidad para cuantificar el movimiento fly. Recientemente, Watanabe y enigma desarrollaron la rotación ejercicio cuantificación sistema (requisitos), una columna vertebral TW modificada con una actividad de control de unidad (LAM25H) del sistema de monitoreo de Drosophila serie15,21. Como el TW, este sistema utiliza el movimiento de rotación para inducir suavemente ejercicio mientras usa el brazo LAM25H rastrear y cuantificar la actividad de la mosca, pero tiene un menor número de viales (frascos de 32) que las TW15. Para estudios de ejercicio de alto rendimiento, si la cuantificación de la actividad no es necesario o deseado, el TW permite un mayor número de muestra. El diseño TW también podría ser modificado desde su forma actual para dar cabida a un mayor número de frascos. Este sistema, junto con otros métodos de ejercicio existentes, ayuda a establecer que el ejercicio no sólo es factible en Drosophila pero también puede ser estudiada para determinar el efecto de la actividad física en una variedad de respuestas fisiológicas y moleculares 11,12,15. Así, el TW, como un método de inducir ejercicio suave en moscas, puede utilizarse para una gran variedad de cuestiones biológicas.

Infancia y obesidad adultos están creciendo las epidemias en las culturas que consumen dietas altas en calorías y permanecen inactivo durante largos períodos de tiempo, que puede conducir a graves consecuencias a largo plazo, incluyendo resistencia a la insulina, la inflamación crónica y osteoartritis 1 , 2 , 3 , 4. la prevalencia de estos trastornos sigue aumentando debido al creciente desequilibrio en la ingesta calórica y el gasto atribuido al elevado consumo de grasas y azúcares y un sedentarismo principalmente5. En consecuencia, este desequilibrio de la energía ha llevado a un aumento en casos de Diabetes Mellitus de tipo 2 (T2DM) y Enfermedad Cardiovascular (ECV)5. Los individuos están en un riesgo mayor de desarrollar ambas patologías si ha sido diagnosticados con el trastorno, el síndrome metabólico (MetS), cuyos síntomas incluyen obesidad abdominal y dislipidemia2. MetS se forma por las complejas interacciones entre el genotipo y diversos factores ambientales, como dieta y ejercicio6. Por lo tanto, para obtener un completo entendimiento de los mecanismos subyacentes de esta compleja enfermedad, todos estos factores deben considerarse.
Cuando se trata de la lucha contra los MetS, los doctores recomiendan primero experimentando cambios de estilo de vida que incluyen comer una dieta sana y equilibrada y actividad física2,7,8. Desde medicamentos eficaces son limitados y la cirugía de bypass gástrico es costosa y requiere supervisión médica permanente, intervención farmacológica y quirúrgica sólo se recomienda para los casos graves y sólo en combinación con estos cambios de estilo de vida3 ,7,8. Mientras que las intervenciones de estilo de vida, tales como ejercicio y dieta, pueden producir y mantener objetivos de pérdida de peso a largo plazo, o no estas medidas correctoras pueden mejorar completamente los efectos negativos asociados con MetS necesita más estudio de7, 8.
Modelos de ratón han sido utilizados para examinar los efectos del ejercicio en enfermedades metabólicas durante años; sin embargo, la introducción del ejercicio volar investigación en MetS es un esfuerzo relativamente reciente9,10,11,12. Moscas de proporcionan el vehículo perfecto para estudiar el ejercicio en un entorno de laboratorio controlado, ya que son fácilmente manipulados, tienen una vida corta, son barato de mantener y rutas metabólicas energéticas están muy conservadas entre Drosophila y los seres humanos13. Genoma de D. melanogaster está bien caracterizada, y existe una amplia variedad de herramientas de genética para su uso en Drosophila que puede proporcionar la penetración en diferentes genotipos y las interacciones genotipo por ambiente que podrían modular la efecto del ejercicio sobre la salud14.
Los métodos actuales de ejercicio de Drosophila invocan tendencia de geotaxis negativa, innata de la mosca, el instinto de comportamiento para escalar hacia arriba, para estimular la escalada en adultos dentro de sus recintos11,12,15 . La torre de la energía, un método para estimular el ejercicio de moscas, plantea sistemáticamente los recintos volarás verticalmente y luego cae les detrás a la superficie del Banco, efectivamente golpeando las moscas en el fondo del frasco, así induciendo su instintiva geotaxis negativa 12 , 16. experimentos realizados utilizando esta máquina mostraron que el ejercicio es un poderoso factor protector contra muchas enfermedades relacionadas con la edad, incluyendo enfermedades cardiovasculares y el T2DM y promueve un envejecimiento saludable12,17,18 . En concreto, demostró que ejercicio puede reducir la aparición de la movilidad relacionada con la edad disminución de moscas y mejorar síntomas múltiples relacionados con la edad, tales como el desempeño cardíaco y tensión respuesta17,18. Sin embargo, control vuela nunca colocado en la torre mostraron puntuaciones más altas de escalada que experimenta la máquina, lo que sugiere la fuerza de las caídas repetitivas puede herir a las moscas y que afectan a la movilidad12. Esto sugiere que un método alternativo de inducir el ejercicio que es menos vigorosa y evita causar trauma físico sería un método útil, complementario a la torre de la energía protocolo16.
Para inducir suavemente ejercicio en Drosophila, hemos desarrollado una máquina de ejercicio llamada la rueda (figura 1). La rueda de (en adelante abreviado como TW) movimiento de rotación provoca tendencia geotaxis negativa, innata de las moscas, redefiniendo constantemente arriba gravitacional de los viales, que a su vez, estimula la escalada en las moscas. A diferencia de otros métodos, el movimiento de rotación del TW es inherentemente apacible, que reduce al mínimo el número de estresores adicionales que pueden surgir y afectar los resultados. Así, la máquina proporciona los medios para inducir el ejercicio en gran número de moscas sin provocar estrés, lo que permitirá a los investigadores a estudiar los efectos del ejercicio sobre la salud metabólica (figura 2), envejecimiento, sueño y muchos otros temas11.
Nuestro método sigue un inverso piramidal, el protocolo de entrenamiento de intervalo, que en gran medida incorpora aspectos del aeróbico intervalo entrenamiento (AIT) con alguna resistencia de entrenamiento del ejercicio. El régimen estándar de AIT se altera en este protocolo para aumentar gradualmente la duración de cada intervalo durante un período de cinco días para promover la resistencia. AIT ha sido particularmente útil en la prevención de MetS en comparación con otros métodos de intervención y fue más efectiva en la reversión de factores de riesgo comunes de síndrome metabólico de continuo ejercicio moderado19,20. Sin embargo, una desventaja de la TW en relación con la torre de la energía es que vuela más rápidamente habituarse al movimiento de rotación, así la variación en la tendencia innata a habituar entre las moscas puede complicar la interpretación de los beneficios del ejercicio. 11 una solución elegante a esta limitación es descrita por Watanabe y enigma15 y sus complementarios artículo21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:844px;" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Materials for TreadWheel Construction:</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heavy Duty Vibration-Damping leveling Mount</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>60855K71</td>
			<td>Quantity: 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel Ball Bearing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>57155K306</td>
			<td>Quantity: 8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plug-in Voltage Transformer (500MA, 120VAC input, 24 VAC output)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>70235K16</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compact Square-Face DC Gear motor</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6409K23</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tool Holder (clamps)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1723A22</td>
			<td>Quantity: 5 (10x)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12L14 Carbon Steel Tight-Tolerance Rod</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5227T24</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Set Screw Shaft Collar</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6432K13</td>
			<td>Quantity: 8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-Belt Pulley</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6284K51</td>
			<td>Quantity: 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dart Controls &#8211; 25 Max RPM, Electric AC DC Motor</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>13DV 1A</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Materials for Fly Maintenace and Husbandry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz Square Bottom Bottles (polypropylene)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-130</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35x10mm Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-536</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narrow Drosophila vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-116</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">Flystuff Flypad</td>
			<td style="width:112px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:171px;">59-114</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">Blowgun, Mini</td>
			<td style="width:112px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:171px;">54-104</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Materials for RING-like Assay:</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:112px;">NIH</td>
			<td style="width:171px;">https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">1 cM graph paper or drawn grid (at least 20 cM by 30 cM)</td>
			<td style="width:112px;">various</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">digital camera with timer or smart phone with camera timer app</td>
			<td style="width:112px;">various</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Materials for Triglyceride Assay:</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dewar Flask</td>
			<td style="width:112px;">VWR</td>
			<td>14200-960</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serum Triglyceride Determination Kit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TRO100</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cordless Pestle Motor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47747-370</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Pestles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47747-358</td>
			<td>Quantity: 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the treadwheel: interval training protocol for gently induced exercise in drosophila melanogaster

La incidencia de enfermedades metabólicas complejas ha aumentado como resultado de una transición generalizada hacia estilos de vida de aumento en la ingesta calórico y los niveles de actividad baja. Estas enfermedades multifactoriales se presentan de una combinación de factores genéticos, ambientales y conductuales. Una de esas enfermedades compleja es síndrome metabólico (MetS), que es un grupo de trastornos metabólicos, incluyendo hipertensión, hiperglucemia y obesidad abdominal. Ejercicio e intervención dietética son los tratamientos primarios recomendados por los médicos para mitigar la obesidad y sus enfermedades metabólicas subsiguientes. Intervención de ejercicios, entrenamiento, en especial aeróbico interválico estimula cambios favorables en los factores comunes de riesgo para Diabetes Mellitus de tipo 2 (T2DM), Enfermedad Cardiovascular (ECV) y otras condiciones. Con la llegada de pruebas describiendo el ejercicio efecto terapéutico tiene en la salud metabólica, establecer un sistema de modelos de ejercen en un ambiente controlado proporciona una valiosa herramienta para evaluar los efectos del ejercicio en un contexto experimental. Drosophila melanogaster es una gran herramienta para la investigación de los cambios fisiológicos y moleculares que resultan de la intervención de ejercicios. Las moscas tienen vida corta y mecanismos similares de metabolizar nutrientes en comparación con los seres humanos. Para inducir el ejercicio en Drosophila, se desarrolló una máquina llamada la rueda, que utiliza la tendencia de geotaxis negativa, innata de la mosca para inducir suavemente a subir. Esto permite a los investigadores a realizar experimentos en grandes cohortes de moscas genéticamente diversas para comprender mejor las interacciones genotipo por ambiente subyacente a los efectos del ejercicio sobre la salud metabólica.

Estamos especialmente interesados en la identificación de los factores que contribuyen a la salud global metabólica de un individuo. Anteriormente se encontró que las interacciones genotipo por dieta contribuyen sustancialmente a la variación de nivel de población en rasgos metabólicos14. Esto significa que cada genotipo responde a las diferencias ambientales de una manera única y compleja. Para extender nuestro trabajo sobre los efectos del genotipo por ambiente para incluir ejercicio físico, se desarrolló la rueda, que es capaz de exponer la gran cantidad de genotipos aeróbico intervalo entrenamiento (AIT) en forma de alto rendimiento.
Para establecer si el ejercicio en el TW influenciado rasgos metabólicos, medimos el almacenamiento de triglicéridos en Oregon-R (OreR) y y1w1 moscas, moscas comunes de tipo salvaje (figura 2B – C) y normalizado los valores contra las moscas concentración de la proteína, tal como se informó en Méndez et al. 11. analizamos los datos por análisis multivariado de varianza (MANOVA) contabilidad para genotipo, sexo, ejercicio de tratamiento (y sus interacciones), y efectos de bloque experimental como tiempo repeticiones y alimentos vial y encontraron que había una significativa interacción genotipo por ejercicio (p = 0,0017) que afectan el almacenamiento de triglicéridos. Hubo un efecto significativo de dimorfismo sexual entre machos y hembras, con machos almacenar triglicéridos más que las hembras (p < 0.0001). Vimos que en las hembras, ejercitadas moscas tenían niveles de triglicéridos significativamente más bajos que sus contrapartes de unexercised (figura 2B, p < 0.0001). En los varones, mientras que la disminución en el almacenamiento de triglicéridos observada en Oregon-R ejercitó moscas (en comparación con los controles) no fue estadísticamente significativa, se observó una diferencia significativa en el almacenamiento de triglicéridos entre las dos líneas separadas (figura 2C, p < 0.0001). Tenga en cuenta que mientras que la normalización de la concentración de triglicéridos contra la concentración de proteína proporciona visión general mosca cuerpo relaciones de composición, comparación de la concentración de triglicéridos o proteína directa entre los diferentes grupos de moscas también puede proporcionar información específica sobre el efecto del ejercicio en estos fenotipos individualmente.
Ya que variables como ejercicio de adultos, sexo, genotipo han demostrado afectar el almacenamiento de triglicéridos, se esperaba que estos factores también afectan otros fenotipos e interactúan con dieta. Nos planteamos las larvas de un tipo salvaje representante Drosophila genética Panel de referencia línea (DGRP 153)25 en un alto grado en grasas o un dieta normal y ejercicio inducido en moscas adultas durante una semana (figura 2A). Posteriormente, se realizó un ensayo de anillo geotaxis negativa para medir capacidad. Los análisis de escalada utilizados difieren de un ensayo de anillo estándar; en lugar de un aparato de anillo, frascos con película de parafina que cubre las aberturas fueron utilizados para moscas domésticas durante el ensayo. Otros aspectos del ensayo de anillo original, como el tiempo entre la golpeando las moscas hasta el fondo del frasco y la foto, fueron retenidas22.
Todos los tratamientos se repitieron tres veces separadas con un mínimo de 59 moscas individuales por tratamiento y repetición del tiempo. Los datos fueron analizados por contabilidad de MANOVA para dieta, genotipo, sexo, ejercicio tratamiento (y sus interacciones), así como efectos de bloque experimental del tiempo de repetición, análisis vial y vial ensayo repetición. Encontramos que las hembras ejercitadas subieron significativamente superior (p < 0.005) cuando se crían en la dieta alta en grasas que cualquiera de los otros tratamientos femeninos (figura 2D). Para los varones, se observó que sólo ejercicio mejorado escalada cuando los hombres fueron levantados en la dieta normal, y los criados en la dieta alta en grasas no mostró cambios significativos (figura 2E). También se encontró efecto significativo dimorfismo sexual (p < 0.0001) en escalada con los varones suben más que las hembras. El sorprendente resultado de una disminución en el rendimiento después del ejercicio para las hembras de la línea 153 de la DGRP (figura 2D) para las mujeres que consumen una dieta normal que sube (p < 0.0001) es un ejemplo de cómo este tipo de ejercicio no puede ser un intervención uniformemente positiva para todos los genotipos y puede depender de otros factores ambientales. En Méndez et al. 11, hembras de cuatro otras líneas genéticas probadas para su rendimiento sube después de haber surgido en un normal dieta todos mostraron mayor capacidad con entrenamiento. Esto sugiere que la respuesta observada en 153 DGRP es genotipo específica y no una propiedad general del tratamiento de ejercicio TW. La variabilidad en la respuesta a través de sexo, dieta y ejercicio tratamiento grupos indica que hay interacciones significativas de sexo-por-dieta-por-ejercicio que afecta a la capacidad de la línea (p < 0.0001).
Tomados en conjunto, los resultados indican que el impacto del ejercicio sobre la salud metabólica de una mosca adulta puede ser una función de su sexo, genotipo y dieta larvaria. La variación fenotípica observada en respuesta a genotipos, variables de entorno (p. ej., dieta y ejercicio) y el sexo también observado en otros estudios11,12,14,15. Así, el TW y Drosophila pueden ser una estrategia poderosa para dilucidar los factores genéticos y ambientales que forma salud metabólica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57788/57788fig1.jpg"> Figura 1 : Máquina de ejercicio de la rueda. (A) la máquina tiene 48 frascos y tiene una función de velocidad regulable. Aquí se realizaron experimentos a 4 rpm. (B) las moscas experimentales frascos individuales de alimentos fueron trabados en soportes colocados en un eje giratorio. Alimentación y (C) la distancia entre frasco tapón era 6 cm para los frascos del ejercicio y 1 cm para los frascos de control. Los frascos se colocan en la máquina para ejercicio. (D) el ejercicio de pirámide inversa 5 días régimen solía ejercer de moscas adultas. Cada día, otros cinco minutos ha sido añadido a uno de los combates del ejercicio a la rampa encima de la intensidad del ejercicio progresivamente, que modelos de resistencia, entrenamiento a intervalos. Esta figura ha sido modificada desde Mendez et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57788/57788fig1large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57788/57788fig2.jpg"> Figura 2 : Métodos visuales y representativas resultados. (A) métodos de prueba de dieta larvaria y adulta ejercicio efectos de interacción. Las larvas fueron criadas en dieta de alta grasa o normal laboratorio y conectadas a la alimentación normal tras eclosión. Moscas adultas eran separados por sexo, coloca en grupos experimentales y durante cinco días consecutivos. Luego, se llevó a cabo una geotaxis negativa anillo escalada ensayo y moscas fueron congeladas para las mediciones de triglicéridos. Datos de triglicéridos representativos se muestran dos líneas genéticas, Oregon R y y1w1 para hombres (C) y (B). Todas moscas fueron criados en una dieta normal y ejercitados en la edad adulta. Niveles con diferentes letras son significativamente diferentes (p < 0,05) usando un post hoc estudiante t-pruebas. Esta figura contiene un subconjunto de datos que en Méndez et al. 11. se muestran datos representativos de escalada para línea 153 DGRP para hombres (E) y (D). Cada punto representa el rendimiento escalar promedio de 232 o más individuos a través de tres momentos independientes. Barras de error indican un error de estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57788/57788fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/57788/57788supfig1.jpg"> Suplementario Figura 1: un esquema detallado de la rueda. (A) diagrama de la estructura de abrazadera doble vial sirve para conectar los frascos a la máquina. (B) Vista Interior del sistema de arrastre rotacional de la máquina. (C) proyección paralela de cara frontal de la máquina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57788/57788supfig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo de código suplementario: TreadWheel.skp <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57788/TreadWheel.skp" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

La rueda utiliza el movimiento de rotación para inducir suavemente el ejercicio en adultos de Drosophila melanogaster explotando geotaxis negativa, innata de moscas. Permite análisis de las interacciones entre ejercicio y factores como el genotipo, sexo, dieta y su efecto en ensayos fisiológicos y moleculares para evaluar salud metabólica.

La rueda: Protocolo de entrenamiento de intervalo para suavemente inducida por ejercicio en Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

11.6K vistas.  University of Alabama. La rueda utiliza el movimiento de rotación para inducir suavemente el ejercicio en adultos de Drosophila melanogaster explotando geotaxis negativa, innata de moscas. Permite análisis de las interacciones entre ejercicio y factores como el genotipo, sexo, dieta y su efecto en ensayos fisiológicos y moleculares para evaluar salud metabólica.

Video: The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. To assess the impact of PM on nuclear genetic integrity, structural chromosomal aberrations are scored in the metaphase spreads of mouse RAW264.7 macrophage cells. PM is collected from ambient air with a high volume total suspended particles sampler. The collected material is solubilized and filtered to retain the water-soluble, fine portion. The particles are characterized for chemical composition by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Different concentrations of particle suspension are added onto an in vitro culture of RAW264.7 mouse macrophages for a total exposure time of 72 hr, along with untreated control cells. At the end of exposure, the culture is treated with colcemid to arrest cells in metaphase. Cells are then harvested, treated with hypotonic solution, fixed in acetomethanol, dropped onto glass slides and finally stained with Giemsa solution. Slides are examined to assess the structural chromosomal aberrations (CAs) in metaphase spreads at 1,000X magnification using a bright-field microscope. 50 to 100 metaphase spread are scored for each treatment group. This technique is adapted for the detection of structural chromosomal aberrations (CAs), such as chromatid-type breaks, chromatid-type exchanges, acentric fragments, dicentric and ring chromosomes, double minutes, endoreduplication, and Robertsonian translocations in vitro after exposure to PM. It is a powerful method to associate a well-established cytogenetic endpoint to epigenetic alterations.

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

This protocol describes techniques for the quantification and characterization of chromosomal aberrations in vitro in RAW264.7 mouse macrophages after treatment with ambient air particulate matter.

El análisis de la inducida por la materia particulada ambiental aberraciones cromosómicas El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Investigación

Genética

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for understanding the development and evolution of morphological phenotypes. Abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster has been particularly useful, allowing researchers to identify the loci that underlie inter- and intraspecific variations in morphology. Hitherto, however, D. melanogaster abdominal pigmentation has been largely assayed qualitatively, through scoring, rather than quantitatively, which limits the forms of statistical analysis that can be applied to pigmentation data. This work describes a new methodology that allows for the quantification of various aspects of the abdominal pigmentation pattern of adult D. melanogaster. The protocol includes specimen mounting, image capture, data extraction, and analysis. All the software used for image capture and analysis feature macros written for open-source image analysis. The advantage of this approach is the ability to precisely measure pigmentation traits using a methodology that is highly reproducible across different imaging systems. While the technique has been used to measure variation in the tergal pigmentation patterns of adult D. melanogaster, the methodology is flexible and broadly applicable to pigmentation patterns in myriad different organisms.

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

This work presents a method to quickly and precisely quantify the abdominal pigmentation of Drosophila melanogaster using digital image analysis. This method streamlines the procedures between phenotype acquisition and data analysis and includes specimen mounting, image acquisition, pixel value extraction, and trait measurement.

Cuantificación de la Pigmentación Abdominal en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

Alimentación dieta alta en grasas y alto rendimiento Triacylglyceride ensayo en Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel have been described. However, a method to measure the amount of additional animal activity induced through the exercise treatment has been lacking. The Rotating Exercise Quantification System (REQS) fills this need, providing a measure of animal activity for animals experiencing rotational exercise. This protocol details how to use the REQS to assess animal activity during rotational exercise and illustrates the type of data that can be generated. Here, we demonstrate how the REQS is used to measure sex- and strain-specific differences in exercise induced activity. The REQS can also be used to evaluate the impact of various other experimental parameters such as age, diet, or population size on exercise induced activity. In addition, it can be used to compare the efficacy of different exercise training protocols. Importantly, it provides an opportunity to standardize exercise treatments between strains, allowing the researcher to achieve equal amounts of activity between groups if needed. Thus, the REQS is a notable new resource for exercise biologists working with the Drosophila model system and complements existing exercise systems.

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

The Rotating Exercise Quantification System (REQS) can induce exercise in Drosophila melanogaster through rotation while simultaneously measuring the amount of activity performed by the animals. Here, we present a point-by-point protocol detailing how to measure activity levels of animals experiencing rotational exercise treatments using the REQS.

Medición de los niveles de ejercicio de Drosophila melanogaster utilizando la rotación ejercicio cuantificación sistema (requisitos)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

Uso en Vitro y en las células la forma para investigar la molécula pequeña inducida por cambios estructurales Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of individual cell populations often makes it difficult to obtain enough material for molecular studies. For example, the accessory gland of the Drosophila male reproductive system contains two distinct secretory cell types. The main cells make up 96% of the secretory cells of the gland, while the secondary cells (SC) make up the remaining 4% of cells (about 80 cells per male). Although both cell types produce important components of the seminal fluid, only a few genes are known to be specific to the SCs. The rarity of SCs has, thus far, hindered transcriptomic analysis study of this important cell type. Here, a method is presented that allows for the purification of SCs for RNA extraction and sequencing. The protocol consists in first dissecting glands from flies expressing a SC-specific GFP reporter and then subjecting these glands to protease digestion and mechanical dissociation to obtain individual cells. Following these steps, individual, living, GFP-marked cells are sorted using a fluorescent activated cell sorter (FACS) for RNA purification. This procedure yields SC-specific RNAs from ~40 males per condition for downstream RT-qPCR and/or RNA sequencing in the course of one day. The rapidity and simplicity of the procedure allows for the transcriptomes of many different flies, from different genotypes or environmental conditions, to be determined in a short period of time.

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Here, we present a protocol to dissociate and sort a specific cell population from the Drosophila male accessory glands (secondary cells) for RNA sequencing and RT-qPCR. Cell isolation is accomplished through FACS purification of GFP-expressing secondary cells after a multistep-dissociation process requiring dissection, proteases digestion and mechanical dispersion.

Un protocolo basado en FACS para aislar el ARN de las células secundarias de Drosophila Male Accessory Glands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.