El trabajo fue apoyado por la concesión número P30DK056336 desde el Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y riñón enfermedades mediante una subvención de piloto de la nutrición y la obesidad centro de investigación de la Universidad de Alabama en Birmingham a NCR.

Los requisitos consiste en una unidad de Monitor de actividad de Drosophila (para obtener información de la fuente, véase Tabla de materiales) montado sobre un brazo giratorio que está controlado por una unidad motora (figura 1). El monitor de actividad determina la frecuencia en un lapso de tiempo determinado se perturba la matriz de rayos láser el centro del tubo de ensayo de disección. Para dibujos detallados y una caracterización detallada, consulte nuestra anterior publicación9. Mientras que nuestro sistema utiliza la unidad de LAM25H, los requisitos pueden ser modificado para dar cabida a otras unidades de Drosophila Activity Monitor también.
1. la configuración de los requisitos de la prueba
<ol><li>Prueba de carga vuele en tubos de muestra de vidrio de anestesiar los animales con CO2 u otro método elegido para la manipulación, movimiento en los tubos de vacíos y tapado los tubos.</li>
	<li>Inserte tubos de muestra de vidrio tapado en las ranuras de la unidad de monitor de actividad. Fije los tubos de goma O-rings (17-18 gauge) o bandas de goma en ambos lados de la unidad para asegurar los tubos no se mueven durante la rotación:<ol>
<li>Deslice una junta tórica sobre el tubo de muestra y colocar el anillo en o cerca de la mitad del tubo. Inserte el tubo de muestra en una ranura del monitor de actividad de la parte delantera y céntrela.</li>
		<li>Mueva la Junta según sea necesario y asegúrese de que una vez que el tubo de la muestra se centra, el anillo se deslice tan cerca de la unidad del monitor de actividad como sea posible. Fijar el tubo de espécimen deslizando una segunda junta tórica sobre el tubo de vidrio de la parte posterior, otra vez en movimiento la junta tórica como cerca de la unidad de monitor de actividad como sea posible.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniciar la rotación de los REQS poniendo el interruptor en la parte delantera de la unidad. Ajustar la velocidad de rotación con el dial en la parte frontal de la unidad a la velocidad deseada (4 rpm (rotaciones por minuto) en este ejemplo). Nota: La velocidad de giro en este ejemplo fue elegida para que coincida con un estudio previamente publicado7. Diferentes velocidades de rotación resultará en niveles de actividad diferentes de animales, cuando se inicia un nuevo estudio, optimización de velocidad de rotación para el montaje experimental específico (genotipo, duración de ejercicio pelea, etcetera.) puede ser necesario. Nota: Es importante asegurarse de que los tubos estén colocados correctamente para que no arrastre a lo largo de la parte inferior de la unidad de requisitos durante la rotación.</li>
	<li>Pruebe la conexión para el sistema de recolección de datos proporcionado con la unidad del Monitor de actividad de Drosophila abriendo el software de DAMSystem308 y asegurar que la luz de conexión sigue siendo verde varias rotaciones. El software comenzará a grabar datos en un archivo de texto "monitorX" (X es el número de unidad si varios monitores están en uso) inmediatamente sobre la iniciación. Frecuencia de grabación se puede ajustar en la pestaña 'Preferencias'; normalmente grabamos en intervalos de 5 minutos.</li>
	<li>Investigar el archivo de texto generado por el software de DAMSystem308 para asegurar que la conexión de datos está funcionando correctamente. Problemas con la conexión resultan en recortes, momentos donde se registra actividad 0 para todas las posiciones en los requisitos (véase Resultados de representante y tabla 2). Si se producen recortes, ajustar las conexiones de datos a la toma de teléfono giratorio, como durante la rotación, esta conexión puede ser suelto o trenzado. Encontramos que estabiliza la conexión con cinta ayuda a prevenir este problema.</li>
</ol>2. preparación de los animales
Nota: Todos los animales fueron planteados y probados bajo condiciones estándar en una incubadora (25 ° C, 60-70% de humedad, ciclo de 12 h luz/oscuridad) en melaza/harina de maíz media10.
<ol><li>Dos semanas antes del experimento planeado, establecer frascos con densidad controlada de animales para recoger las moscas experimentales por lo general hemos creado frascos con 7 machos y 10 hembras. Con una población sana, de un solo frasco, se pueden recoger sobre un período de 4 días aproximadamente 15 Virgen machos y 15 hembras. Ajustar el número de viales creado basado en el número de animales necesarios para el análisis; un típico análisis en nuestro laboratorio incluye 10 conjuntos de 10 Virgen machos y hembras por genotipo (100 varones y 100 mujeres). Nota: No Virgen moscas pueden utilizarse dependiendo de la pregunta experimental concreta. Si la realización de experimentos a largo plazo con animales no Virgen, larvas reptantes pueden interferir con monitoreo de la actividad precisa.</li>
	<li>Eliminar las moscas de los padres una semana después de la creación de los viales.</li>
	<li>A partir del día 10 después de la creación de los viales, recoger moscas vírgenes de los frascos y guardarlos separados por sexo.</li>
	<li>Recoge suficientes animales para el experimento y la edad como sea necesario, 3 días en este ejemplo. Nota: Típicamente anestesiar los animales con CO2 para la manipulación. CO2 se sabe que afectan los niveles de actividad del animal durante largos períodos de tiempo después del tratamiento (por ejemplo, véase Bartolomé et al 201511). Si el CO2 efecto interfiere con ensayos posteriores previstos o análisis, utilice un método de anestesia diferentes como anestesia de hielo.</li>
</ol>3. recopilación con los requisitos
<ol><li>Anestesiar los animales para el estudio de cuantificación del ejercicio con CO2 o cualquier otro método de anestesia. Divídalos en grupos según sea necesario y los grupos de animales de carga en los tubos de vacío vidrio del monitor de actividad; en este ejemplo, 10 animales de la misma edad se cargan por el tubo de vidrio, con 10 repeticiones para cada tipo de animal (sexo/genotipo). Asegúrese de que tenga en cuenta que tipo de animal se carga en cada tubo. Nota: Para más experimentos, alimentos pueden incluirse en los tubos de muestra. En este caso, es esencial que el alimento es seguro y no desplazarse durante la rotación.</li>
	<li>Cargar los tubos de ensayo de vidrio en la unidad de requisitos y fijar con la goma O-rings. Si trabaja con más de un sexo/genotipo, utilizando un diseño de bloques al azar o aleatorización de la posición de los animales en los requisitos se eliminará cualquier efecto potencial de posición. La aleatorización se logra asignando cada frasco un número aleatorio, por ejemplo de un web basado en generador de números aleatorios (por ejemplo, https://www.randomizer.org/) o en una hoja de cálculo, y luego ordenar los frascos en función del número al azar.</li>
	<li>Coloque los requisitos en la incubadora para temperatura constante, la humedad y la luz de las condiciones. Asegurar que los datos y poder cables están correctamente conectados.</li>
	<li>Permitir a los animales para recuperarse de la anestesia y para aclimatarse al nuevo ambiente durante 1 hora.</li>
	<li>Comenzar el experimento mediante el inicio de rotación de los requisitos a la velocidad deseada. Nota: Otra opción es primero recoger datos de actividad basal de los animales antes del inicio de la rotación, siguió registrando los niveles de actividad en respuesta a la estimulación rotatoria.</li>
	<li>Iniciar la recolección de datos abriendo el software de DAMsystem308 (simplemente la recogida de datos de software inicia la abertura). Los datos se escriben en un archivo de texto en el intervalo (aquí, 5 min); Si es necesario, cambie la configuración de intervalo en la pestaña "Preferencias" (ver paso 1.4).</li>
	<li>Para asegurar que los datos se transmiten con éxito a la computadora, abra el archivo de texto generado por el software de DAMsystem308 después de uno o dos intervalos de tiempo transcurrieron y confirman que se están escribiendo datos en el archivo. Cierre y vuelva a abrir este archivo para ver los datos de los puntos del tiempo adicional. Recopilar datos para la cantidad deseada de tiempo; en este ejemplo, 2 h. Nota: No abra la incubadora durante el período de ensayo, los animales son muy sensibles a cualquier alteración y es probable que responda con una mayor actividad.</li>
	<li>Al final de la prueba de ejercicio, terminar la colección de datos cerrando el software DAMsystem308 y, a continuación, apague los REQS. Retire los tubos de ensayo de vidrio de los animales y limpiar los tubos. Los animales se pueden mover hacia atrás en los frascos de alimentos si son necesarias medidas a diferentes edades. Nota: Si las muertes se producen durante el régimen de ejercicio, se deben registrarse, como la presencia de moscas muertas puede afectar cuentas de actividad. En nuestra experiencia con el DGRP2 las líneas de mosca12,13, ejercicio a 4 rpm 2 h no se produjo ninguna muerte, pero las cepas más débiles podrían responder diferentemente.</li>
</ol>4. Análisis de datos
<ol><li>Abra el archivo .txt con la etiqueta "Supervisor1" producido por el software de DAMSystem308.</li>
	<li>Examine el archivo de datos para cualquier problema que pueda haber ocurrido durante la adquisición de datos (puntos de perdida de tiempo, etc.; Tabla 1). Si es necesario, censurar el archivo quitando los puntos de datos al principio y al final de la grabación.</li>
	<li>Utilizando el software estadístico de su elección (p. ej., R), analizar los datos recogidos. Generar estadísticas descriptivas y realizar análisis de varianza (ANOVA) para investigar efectos como sexo y genotipo, si los datos se distribuyen normalmente. Si los datos no se distribuyen normalmente, utilizar métodos no paramétricos, como las pruebas de Kruskal-Wallis, para comparar grupos. El análisis específicos requeridos dependerá de la pregunta científica específica y el diseño experimental.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rieder, L. E., Larschan, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wisdom+from+the+fly.">Wisdom from the fly.</a> Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+on+the+fly:+A+primer+on+the+Drosophila+Model+System.">Genetics on the fly: A primer on the Drosophila Model System.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li><li>Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-training+in+young+Drosophila+melanogaster+reduces+age-related+decline+in+mobility+and+cardiac+performance.">Exercise-training in young Drosophila melanogaster reduces age-related decline in mobility and cardiac performance.</a> PLoS One. 4 (6), e5886 (2009).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).</li><li>Tinkerhess, M. J., Ginzberg, S., Piazza, N., Wessells, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endurance+training+protocol+and+longitudinal+performance+assays+for+Drosophila+melanogaster.">Endurance training protocol and longitudinal performance assays for Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Mendez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TreadWheel:+A+novel+apparatus+to+measure+genetic+variation+in+response+to+gently+induced+exercise+for+Drosophila.">The TreadWheel: A novel apparatus to measure genetic variation in response to gently induced exercise for Drosophila.</a> PLoS One. 11 (10), e0164706 (2016).</li><li>Katzenberger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+closed+head+traumatic+brain+injury.">A Drosophila model of closed head traumatic brain injury.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (44), E4152-E4159 (2013).</li><li>Watanabe, L. P., Riddle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Rotating+Exercise+Quantification+System+(REQS),+a+novel+Drosophila+exercise+quantification+apparatus.">Characterization of the Rotating Exercise Quantification System (REQS), a novel Drosophila exercise quantification apparatus.</a> PLoS One. 12 (10), e0185090 (2017).</li><li>Reed, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-by-diet+interactions+drive+metabolic+phenotype+variation+in+Drosophila+melanogaster.">Genotype-by-diet interactions drive metabolic phenotype variation in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 185 (3), 1009-1019 (2010).</li><li>Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., VandenBrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+climbing+and+flight+behaviour+in+Drosophila+melanogaster+following+carbon+dioxide+anaesthesia.">Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia.</a> Sci Rep. 5, 15298 (2015).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+genome+architecture+among+205+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel+lines.">Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines.</a> Genome Res. 24 (7), 1193-1208 (2014).</li><li>Mackay, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel.">The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel.</a> Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).</li><li>Berlandi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swing+Boat:+Inducing+and+recording+locomotor+activity+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+Alzheimer's+disease.">Swing Boat: Inducing and recording locomotor activity in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer's disease.</a> Front Behav Neurosci. 11, 159 (2017).</li><li>Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+does+your+mutant+sleep?+Probing+arousal+to+better+understand+sleep+defects+in+Drosophila.">How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila.</a> Sci Rep. 5, 8454 (2015).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Como lo ilustran los resultados representativos, los requisitos es capaz de medir con precisión la actividad de ejercicio de Drosophila. Los requisitos es flexible y permite a los investigadores abordar una variedad de preguntas de investigación relacionadas con las intervenciones de ejercicio o ejercicio biología. Hay dos pasos críticos en el protocolo para resaltar. En primer lugar, es esencial para probar la configuración de los requisitos para garantizar que la transmisión de datos de los requisitos para la DAM...

Recientemente, los investigadores han comenzado a usar la mosca de la fruta Drosophila melanogaster para estudiar la biología del ejercicio. D. melanogaster ha sido un sistema de modelo genético para más de 100 años1,2. Sin embargo, investigaciones de Drosophila ha contribuido no sólo genética, sino también a una variedad de otras disciplinas como la neurobiología, biología del comportamiento y fisiología3. En 2009, la torre de la energía, la primera máquina de ejercicio para Drosophila fue descrito4. La torre de la energía aprovecha respuesta geotaxis negativa de los animales. Cuando perturbada, Drosophila tienden a moverse a la parte superior de su recinto. Esta respuesta está bien establecida y es la base del ensayo popular "RING" (Geotaxis negativa iterativo rápido5) que se utiliza para estimar la capacidad o aptitud física en Drosophila. La torre de la energía utiliza un brazo mecánico conectado a una unidad de motor para levantar repetidamente un conjunto de animales dentro de sus recintos por varias pulgadas y dejarlos volver a la tierra para inducir la respuesta de geotaxis negativa (Tinkerhess et al 20126 proporcionar un video que ilustra el uso de la torre de la energía). Tratamiento prolongado en la torre de la energía por lo tanto aumenta la cantidad de actividad física (correr o volar) los animales realizan en comparación a animales de control no tratados y más tiempo lleva a mejorar el rendimiento en el ensayo de anillo para aptitud física4. Así, este trabajo demostró la factibilidad del uso de Drosophila como modelo para la biología del ejercicio.
Para ampliar el repertorio de herramientas disponibles para la investigación del ejercicio de Drosophila, en 2016, Mendez y sus colegas describen una segunda máquina de ejercicio de Drosophila, la rueda7. Similar a la torre de la energía, la rueda explota la respuesta geotaxis negativa de Drosophila. Sin embargo, esta respuesta es inducida por la rotación continua de los recintos de animales, en lugar de levantar y caer como en la torre de la energía. Este método de inducción es más suave y permite un régimen de ejercicio orientado más resistencia que evita cualquier trauma físico que pudiera ocurrir durante el ejercicio en la torre de la energía (véase Katzenberger, R. J. et al. 20138 impacto de repetido físico trauma en la salud de Drosophila). Similar a la torre de la energía4, tratamiento de animales en la rueda de ejercicio conduce a una variedad de respuestas fisiológicas, incluyendo cambios en la aptitud física, los niveles de triglicéridos y cuerpo peso7. Así, dos métodos complementarios están disponibles para los biólogos de Drosophila estudio de ejercicio.
Una limitación de la torre y la rueda es la incapacidad para medir la cantidad de actividad inducida por el tratamiento de ejercicio. Análisis de grabaciones de video de la rueda demostró que había diferencias significativas entre las diferentes cepas de Drosophila en cómo responden al ejercicio tratamiento7. Concretamente, las cepas estudiaron diferenciaron en cuánto más actividad los animales cuando estimulado7. Esta observación nos llevó a desarrollar un tercer sistema de ejercicio, la rotación ejercicio cuantificación sistema (requisitos), que nos permite medir los niveles de actividad del animal durante el ejercicio inducido por la rotación9. Los requisitos utiliza una actividad comercialmente disponible de unidad que está instalado en un brazo giratorio para estimular el ejercicio a través de la rotación en la rueda de control. Trabajo inicial con los requisitos que confirma genéticamente diferentes cepas de Drosophila y sexos - pueden significativamente diferentes respuestas a la estimulación rotatoria y por lo tanto la cantidad de ejercicio inducida no es idéntica entre diferentes genotipos9 . Por lo tanto, los requisitos ahora permite a biólogos de Drosophila medir la cantidad de ejercicio inducido por el tratamiento, abriendo una variedad de nuevas vías de investigación en el campo de ejercicio.
Aquí describimos en detalle cómo utilizar los requisitos para la cuantificación del ejercicio rotatorio. Los requisitos induce rotación ejercicio y simultáneamente mide los niveles de actividad de los animales tratados. Los requisitos sean capaz de adaptarse a una variedad de programas de ejercicios, que van desde la simple 2 h régimen de ejercicio continuo demostrado aquí a métodos más complejos de entrenamiento de intervalo descrito por Méndez y colegas7y estimulación se puede ajustar mediante velocidad de rotación (entre aproximadamente 1 13 rotaciones por minuto). Dependiendo de la unidad del monitor de actividad utilizada para producir los requisitos, este método es adaptable para el análisis de las moscas individuales o grandes poblaciones de animales. Debido a esta versatilidad, los requisitos ofrece a los investigadores de Drosophila con una variedad de oportunidades para estudiar, por ejemplo, regímenes de ejercicio diferente, las intervenciones de la dieta o impacto de la densidad de población.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Drosophila Activity Monitor&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Trikinetics</td>
			<td style="width:119px;">LAM25H</td>
			<td style="width:287px;">REQS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Telephone Cord Detangler</td>
			<td style="width:147px;">Uvital</td>
			<td>uv20170719</td>
			<td>REQS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vial closures (flugs)</td>
			<td style="width:147px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">49-102</td>
			<td style="width:287px;">Drosophila culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vials&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Genesee Scientific</td>
			<td>32-120</td>
			<td style="width:287px;">Drosophila culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Drosophila culture netting</td>
			<td style="width:147px;">Carolina Biological Supply</td>
			<td style="width:119px;">173090</td>
			<td style="width:287px;">Drosophila culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cornmeal</td>
			<td style="width:147px;">Pepsico</td>
			<td>43375</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Molasses</td>
			<td style="width:147px;">Golden Barrel</td>
			<td>BLA-GAL</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:147px;">Apex Bioresearch</td>
			<td style="width:119px;">66-103</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inactive Dry Yeast</td>
			<td style="width:147px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">62-106</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tegosept</td>
			<td style="width:147px;">Apex Bioresearch</td>
			<td style="width:119px;">20-258</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propionic acid</td>
			<td style="width:147px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20-271</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring exercise levels in drosophila melanogaster using the rotating exercise quantification system (reqs)

Drosophila melanogaster es un nuevo organismo modelo para estudios en Biología del ejercicio. Hasta la fecha, dos sistemas de ejercicio principal, la torre de la energía y la rueda se han descrito. Sin embargo, ha faltado un método para medir la cantidad de actividad animal adicional inducida por el tratamiento de ejercicio. La rotación del ejercicio cuantificación sistema (requisitos) llenan esta necesidad, proporcionando una medida de la actividad animal animales experimentan rotación ejercicio. Este protocolo detalla cómo utilizar los requisitos para evaluar actividad animal durante el ejercicio de rotación e ilustra el tipo de datos que se pueden generar. Aquí, demostramos cómo los requisitos se utilizan para medir diferencias específicas por sexo y tensión en actividad de ejercicio inducido. Los requisitos pueden utilizarse también para evaluar el impacto de varios otros parámetros experimentales tales como edad, dieta o la población tamaño ejercicio inducida por actividad. Además, puede utilizarse para comparar la eficacia de protocolos de entrenamiento de ejercicio diferente. Lo importante, proporciona una oportunidad para estandarizar tratamientos ejercicio entre cepas, lo que permite al investigador alcanzar cantidades iguales de actividad entre los grupos si es necesario. Así, los requisitos es un nuevo recurso notable para los biólogos de ejercicio trabaja con el sistema de modelo de Drosophila y complementa los sistemas existentes de ejercicio.

El resultado de una gestión individual con los requisitos es una tabla de datos producida por el software DAMSystem308, que será marcado "Monitor1.txt" por defecto (por un ejemplo suplementario 1 de archivo). Un fragmento de dicha tabla se muestra en la tabla 1. Cada columna contiene los datos de un tubo de ensayo individuales, mientras que las filas contienen la actividad medida en cada intervalo de tiempo desde el inicio del experimento (parte superio...

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Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

La rotación del ejercicio cuantificación sistema (requisitos) pueden inducir ejercicio en Drosophila melanogaster a través de la rotación mientras que simultáneamente mide la cantidad de actividad de los animales. Aquí, presentamos un protocolo de punto por punto detallando cómo medir los niveles de actividad de los animales experimentan tratamientos ejercicio rotacional usando los REQS.

Medición de los niveles de ejercicio de Drosophila melanogaster utilizando la rotación ejercicio cuantificación sistema (requisitos)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

measuring-exercise-levels-drosophila-melanogaster-using-rotating

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

7.4K vistas.  University of Alabama at Birmingham. La rotación del ejercicio cuantificación sistema (requisitos) pueden inducir ejercicio en Drosophila melanogaster a través de la rotación mientras que simultáneamente mide la cantidad de actividad de los animales. Aquí, presentamos un protocolo de punto por punto detallando cómo medir los niveles de actividad de los animales experimentan tratamientos ejercicio rotacional usando los REQS.

Video: Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for understanding the development and evolution of morphological phenotypes. Abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster has been particularly useful, allowing researchers to identify the loci that underlie inter- and intraspecific variations in morphology. Hitherto, however, D. melanogaster abdominal pigmentation has been largely assayed qualitatively, through scoring, rather than quantitatively, which limits the forms of statistical analysis that can be applied to pigmentation data. This work describes a new methodology that allows for the quantification of various aspects of the abdominal pigmentation pattern of adult D. melanogaster. The protocol includes specimen mounting, image capture, data extraction, and analysis. All the software used for image capture and analysis feature macros written for open-source image analysis. The advantage of this approach is the ability to precisely measure pigmentation traits using a methodology that is highly reproducible across different imaging systems. While the technique has been used to measure variation in the tergal pigmentation patterns of adult D. melanogaster, the methodology is flexible and broadly applicable to pigmentation patterns in myriad different organisms.

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

This work presents a method to quickly and precisely quantify the abdominal pigmentation of Drosophila melanogaster using digital image analysis. This method streamlines the procedures between phenotype acquisition and data analysis and includes specimen mounting, image acquisition, pixel value extraction, and trait measurement.

Cuantificación de la Pigmentación Abdominal en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Investigación

Genética

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

Alimentación dieta alta en grasas y alto rendimiento Triacylglyceride ensayo en Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

Medición de los niveles de mRNA con el tiempo durante la levadura S. cerevisiae por respuesta hipóxica

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

Mediada por CRISPR reorganización de la estructura de bucles de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and lowered activity levels. These multifactorial diseases arise from a combination of genetic, environmental, and behavioral factors. One such complex disease is Metabolic Syndrome (MetS), which is a cluster of metabolic disorders, including hypertension, hyperglycemia, and abdominal obesity. Exercise and dietary intervention are the primary treatments recommended by doctors to mitigate obesity and its subsequent metabolic diseases. Exercise intervention, in particular aerobic interval training, stimulates favorable changes in the common risk factors for Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM), Cardiovascular Disease (CVD), and other conditions. With the influx of evidence describing the therapeutic effect exercise has on metabolic health, establishing a system that models exercise in a controlled setting provides a valuable tool for assessing the effects of exercise in an experimental context. Drosophila melanogaster is a great tool for investigating the physiological and molecular changes that result from exercise intervention. The flies have short lifespans and similar mechanisms of metabolizing nutrients when compared to humans. To induce exercise in Drosophila, we developed a machine called the TreadWheel, which utilizes the fly&#39;s innate, negative geotaxis tendency to gently induce climbing. This enables researchers to perform experiments on large cohorts of genetically diverse flies to better understand the genotype-by-environment interactions underlying the effects of exercise on metabolic health.

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel uses rotational motion to gently induce exercise in adult Drosophila melanogaster by exploiting flies&#39; innate, negative geotaxis. It allows for analysis of the interactions between exercise and factors, such as genotype, sex, and diet, and their effect on physiological and molecular assays to assess metabolic health.

La rueda: Protocolo de entrenamiento de intervalo para suavemente inducida por ejercicio en Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

Purificación de células poco abundantes en el sistema Visual de Drosophila

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Medición de los niveles de ejercicio de Drosophila melanogaster utilizando la rotación ejercicio cuantificación sistema (requisitos)

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Cuantificación de la Pigmentación Abdominal en