Este trabajo fue apoyado por una subvención del NHLBI para RW.

1. Configuración de encendido y operación de la Torre <ol><li> La torre de alimentación se coloca en una pieza rectangular de madera contrachapada que se sujeta a una tabla. Un 4,5 rpm engranaje del motor de Grainger se apoya en la parte superior de cuatro 2 &quot;x6&quot; juntas y un ¾ de pulgada de tablero contrachapado. El motor, un control de velocidad de CA / CC, un fusible, y un interruptor on / off están conectados juntos en una caja de unión. </li><li> Para enfriar el motor, un agujero de 3 pulgadas de diámetro se corta en una pieza vertical de media pulgada de madera contrachapada. Por un lado, un ventilador 3-pulgadas está unido a la madera contrachapada, y por el otro, un cilindro de diámetro de 3 pulgadas de metal se adjunta. </li><li> Un brazo a medida que gira con un rodillo montado en el extremo está conectado al motor. El motor y el brazo adjunto girar en una dirección hacia la derecha, empujando hacia abajo una parte de un stock de tubo doblado ¾ pulgada cuadrada que está unido a la madera contrachapada con una bisagra de la puerta. Una rueda está unido al lado superior del material del tubo por debajo de la plataforma para permitir que gire contra la plataforma que es directamente por encima de ella. </li><li> El brazo empuja hacia abajo en un extremo de la población de tubo y levanta el extremo opuesto, levantando una plataforma de dos niveles (Figura 1D). Cuando el rodillo en el brazo despeja el stock de tubo que permite que el brazo para volver a la posición inicial, dejando caer la plataforma hacia abajo (Figura 1F). </li><li> Las plataformas consisten en bastidores que se colocan en la parte superior de la madera contrachapada y se asegura con cuerdas elásticas que se enganchan en los ojos de los tornillos. Las plataformas se deslizan hacia arriba y hacia abajo a lo largo de correderas de cajón que se adjuntan a la madera contrachapada con los soportes. </li><li> Los viales se colocan en los bastidores y se asegura con una pantalla de malla cuadrada que se sujeta con cuerdas elásticas. </li><li> Un cojín de espuma de poliestireno se coloca debajo de la plataforma para amortiguar el choque de la gota. </li><li> La potencia del motor se ajusta de tal manera que un período de rotación completa es de 15 segundos de duración. </li></ol> 2. Protocolo de Ejercicio <ol><li> Las moscas están alojados en una incubadora de 25 ° C con 50% de humedad y una luz de 12 horas / daRK ciclo. Tanto la práctica de ejercicio y la evaluación de la capacidad de ejercicio se llevan a cabo en un 25 ° C de temperatura controlada habitación. </li><li> Las moscas se recogen y la misma edad-dentro de 1-2 días el uno del otro. Un mínimo de 240 moscas es necesaria para el seguimiento longitudinal de geotaxis resistencia y negativa (escalada) capacidad, dos indicadores fisiológicos que reflejan los efectos del entrenamiento. Seguimiento longitudinal permite el aislamiento de los cambios inducidos en relación con los valores de partida para cada cohorte, sin efectos de confusión de la variación entre las cohortes. Moscas para experimentos adicionales se deben recoger, según sea necesario. </li><li> Después de la recolección, las moscas se dividen en 120 moscas experimentales, los cuales serán sometidos al régimen de ejercicio, y 120 el control de moscas, que no será ejercida. Las moscas se almacenan en frascos de 20 moscas cada uno. Los viales de moscas experimentales se tapan con Flugs firma de acetato de celulosa y los viales de control (no ejercitada) las moscas están conectados con un suave SPOtapones de ESN, que puede ser empujado hacia abajo para inmovilizar a las moscas, mientras que en la torre de energía. Esponja se utiliza para la inmovilización debido a que su tamaño adaptativo permite una fácil colocación en la parte inferior del vial. El material de esponja suave reduce las lesiones causadas por los Flugs más sólidas. </li><li> Las moscas de la torre de la energía se almacena y se ejerce en los frascos que contienen 5 ml de alimentos, lo que les proporciona un aterrizaje más suave que las moscas que se ejercen en los viales vacíos. Los alimentos se componen típicamente de 10% de sacarosa, 10% de levadura, y 2% de agar en agua, aunque no se observa moscas para comer a menudo durante el curso de una sesión de entrenamiento. Si los viales vacíos se utilizan durante el entrenamiento, el porcentaje de moscas que sufren lesiones aumenta drásticamente. </li><li> La torre de la energía se utiliza en un ambiente de temperatura controlada que se mantiene a 25 ° C. Moscas experimentales se colocan en la torre de la energía y el hecho de subir. Control de las moscas también se colocan en la torre de la energía, pero el tapón de esponja es Pushed abajo en el vial de aproximadamente 3 mm por encima de las moscas con el fin de limitar el movimiento. Este grupo sirve como un control para los efectos de la torre de la energía que no están relacionados con el ejercicio. A pesar de un cierto margen todavía existe para estas moscas para maniobrar, hemos observado repetidamente que las moscas en estas condiciones corren muy poco y no demostrar una respuesta fisiológica al ejercicio. También puede ser deseable incluir un grupo de control adicional que no se coloca en la torre de la energía en absoluto. </li><li> Las moscas se ejercen cinco días consecutivos cada semana, utilizando un programa de rampa (Figura 2). Durante una semana las moscas se ejercen durante 2 horas por sesión, dos por semana durante 2,5 horas por sesión, y de tres semanas durante 3 horas por sesión. Aunque otros regímenes se han probado, este protocolo produce resultados consistentes a través de genotipos y en condiciones divergentes. Este protocolo es, sin embargo, sujeto a una amplia gama de posibles variaciones que puedan adaptarse a un experimento en particular. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. El ejercicio y la fatiga Locomotor <ol><li> Hora a la fatiga durante el ejercicio de resistencia es un indicador útil para confirmar fisiológica y / o cuantificar la capacidad de ejercicio de una cohorte dada. Los ensayos de fatiga se puede realizar longitudinalmente en cohortes que serán utilizados en los experimentos de formación. Los ensayos pueden realizarse ya sea antes de la formación, después de la terminación del protocolo de entrenamiento, o ambos. Otros puntos de tiempo intermedios se pueden agregar si trazar el progreso incremental durante el entrenamiento que se desea. El ensayo de fatiga también puede ser utilizado para medir la resistencia al ejercicio como una respuesta a otros tratamientos que el protocolo de formación, tales como la alteración dieta (Figura 3B). </li><li> Los ensayos de fatiga se llevó a cabo en un día en la formación no está teniendo lugar. Tanto el moscas experimentales y de control se colocan en la torre de la energía en viales de 20 cada uno y el hecho de subir hasta que se agote. La fatiga es reconocida como la falta de respuesta a un estímulo negativo con la escalada geotaxis serconducta. Comportamiento a la fatiga se obtuvo mediante la observación visual. </li><li> Un vial de las moscas que se considera &quot;fatigado&quot;, cuando 5 o menos las moscas son capaces de subir más de 2 pulgadas de cuatro caídas consecutivas. Viales fatigados se retiran de la torre de la energía, mientras que todavía está funcionando, y el momento del traslado se registra. Los tiempos de extracción se pueden representar como un histograma anidado, o como un &quot;time-to-fracaso&quot; trama. Un ejemplo de datos representados como un &quot;time-to-fracaso&quot; representación se muestra en la Figura 3B. </li><li> Los viales se controla a intervalos de 10 minutos para un máximo de 10 horas (Figura 3B). </li></ol> 4. El ejercicio, la edad y capacidad locomotora <ol><li> Dado que este protocolo de entrenamiento se basa en el comportamiento inducido por correr, un ensayo principal para cuantificar los efectos del entrenamiento consiste en medir el cambio longitudinal en el promedio de la velocidad de carrera durante el entrenamiento. Durante el curso de formación, de 120 moscas cohortes de moscas ejercidos y no ejercitada se ponen a prueba a diario por su respuesta a una s geotaxis negativotimulus. La técnica descrita en ANILLO Gargano et al. (2005) se utiliza para medir la habilidad de las moscas subir 12. En pocas palabras, esta técnica mide la altura promedio se incrementó un vial de moscas durante un tiempo determinado después de la inducción de la geotaxis negativos. La altura subió durante un tiempo definido es equivalente a la escalada de velocidad. Las mediciones se realizan antes de colocar las moscas en la máquina para el entrenamiento diario con el fin de evitar las complicaciones de la fatiga después de la carrera del día. </li><li> En nuestro protocolo estándar, las moscas se ejercen para un total de tres semanas y la capacidad de escalar es examinada por un total de cinco semanas: tres semanas durante el ejercicio de entrenamiento y dos semanas después de la cesación de ejercicio (Figura 2). Esto permite que el experimentador para trazar si los efectos del ejercicio sobre la movilidad persisten después de la interrupción del programa. </li><li> Cuatro fotografías de la actuación de cada cohorte ANILLO día se utilizan para el análisis de la capacidad de trepar. Seis viales se incluyen en cada fotografía. Negativo geotaxis es inducido, y el uso de una cámara temporizado, se toma una fotografía después de un número definido de segundos. Se suelen utilizar dos segundos, aunque esto puede variar dependiendo de las condiciones experimentales. Para cada fotografía, cada vial se divide en cuatro cuadrantes de la misma altura, y el software de procesamiento de imágenes se utiliza para asignar a cada mosca una puntuación basada en el cuadrante que dentro del periodo de tiempo asignado. Las moscas que suben hacia el cuadrante superior recibirá una puntuación de 4, las moscas en el cuadrante superior más cercana recibirá un 3, vuela en el cuadrante segundo más alto recibe un 2, y las moscas en el cuadrante más bajo recibirá un 1. Las moscas que no se suban fuera de la parte inferior del todo se les da una puntuación de 0. </li><li> Para todos los viales en una fotografía determinada, un &quot;índice de la escalada&quot; es generado por un promedio de las puntuaciones de todas las moscas de ese frasco. Cada vial de los índices de las cuatro fotografías se promedian para obtener un índice escalada final para ese día. </li><li> Todos los experimentos se llevan a cabo geotaxis negativos longitudinaldinally. Los resultados se normalizaron a la inicial de &quot;pre-ejercicio&quot; cuenta con el fin de reducir el efecto de la variación en la cohorte de capacidad para trepar y poner de relieve el cambio relativo longitudinal en la capacidad de escalar una cohorte como el resultado de la práctica de ejercicio. La puntuación inicial se determina por el promedio de los índices de los tres primeros días de escalada y se le asigna un valor de 1. Los ensayos posteriores se expresa entonces como un porcentaje del índice inicial. </li></ol> 5. Los resultados representativos De tipo salvaje moscas responder a un protocolo de resistencia con una disminución relacionada con la edad disminución de la capacidad de trepar que persiste después de la final de la formación, tal como se refleja en los ensayos de ANILLO longitudinales a través de cinco semanas de edad (Figura 3). Esta disminución retardada en geotaxis negativos es una respuesta estándar fenotípica que puede servir como un control positivo para asegurar que la respuesta de tipo salvaje ejercicio se está produciendo normalmente. Este conjunto de datos se presenta como un ejemplo de cómo ella inducción de ejercicio por el programa de la torre de alimentación puede ser utilizado como una entrada de comportamiento. La capacidad de los diversos factores genéticos o ambientales que modulan este efecto puede ser evaluado. A la inversa, la torre de alimentación también se puede utilizar como una salida en diversos diseños experimentales. Por ejemplo, el genotipo, la dieta, u otras condiciones pueden ser variadas. Entonces, el efecto de estas variaciones en la fisiología del ejercicio se puede probar mediante la Torre de Poder. Aquí, se muestra un ejemplo de este enfoque. Cuando vuela con un porcentaje variable de sacarosa en sus dietas se ensayaron para determinar el tiempo al contenido fatiga, sacarosa mayor correlación con una mayor capacidad de resistencia (Figura 3B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3786/3786fig1.jpg" /> Figura 1. Funcionamiento de la torre de la energía. (CA) El brazo motorizado doblada con rodillo adjunto gira en sentido horario hasta que entre en contacto con el tubo cuadrado doblado. (D, E) Labrazo empuja hacia abajo el tubo cuadrado doblado, haciendo que la plataforma que está cargado con los viales de moscas para levantar. (F) A medida que el brazo despeja el tubo se permite la plataforma a caer hacia abajo, forzando a las moscas para volver a la parte inferior de la vial. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3786/3786fig2.jpg" /> Figura 2. Sugerido protocolo de ejercicio. Las moscas sometidas al protocolo de entrenamiento se realizan para ejercer durante cinco días a la semana en un período de tres semanas de largo régimen rampa que aumenta progresivamente la duración del ejercicio de las primeras 2 horas, 30 minutos cada semana. Análisis estándar se incluyen los ensayos de fatiga antes y después del programa de ejercicios y ensayos de los anillos de la semana 1 hasta la semana 5. Todos los ensayos se realizaron por duplicado en un número igual de moscas no ejercidas como un control negativo. Otras varias pruebas fisiológicas o bioquímicas puede llevarse a cabo según lo determinado por el investigador. <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3786/3786fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Los ejercicios de resistencia altera múltiples aspectos de la movilidad. (A) realiza ensayos ANILLO longitudinalmente a través de las edades en un solo par de hombres Y 1 W 67C23 cohortes. Emparejados por edad, genéticamente idénticos ejerce y no ejercidas control de las moscas se midieron todos los días para la velocidad media de escalada. Los resultados se expresan en términos de un índice de escalada que se normaliza a la altura media de escalada a través de los tres primeros días de la medición. Entrenados por el ejercicio mostraron una disminución de las moscas relacionada con la edad disminución de la capacidad geotaxis negativo en comparación con los hermanos de la misma edad no ejercitadas a través de las edades (2-way ANOVA, p &lt;0,005). (B) los ensayos de fatiga a cabo durante 8 horas en emparejados por edad moscas hembra Cantón S mostró un efecto significativo de contenido de sacarosa en la dieta el tiempo de fatiga (log-rank, p &lt;0,0001). Antes de experimento, las moscas fueron alimentados con una dieta de levadura / sacarosa / agar, con 10% peso / volumen síla concentración de ST, y un porcentaje variable de sacarosa dietética. Cinco viales de 20 moscas cada uno, fueron probados para cada dieta. Gráfico muestra cómo viales muchos todavía tienen cinco o más moscas se ejecutan en un momento dado. Estos resultados pueden ser tratados estadísticamente y gráficamente como la supervivencia (o tiempo hasta el fracaso) de la curva, con el &quot;fracaso&quot; de un vial que se define como un momento en que menos de cinco moscas siguen respondiendo a los estímulos geotaxis negativo. Tenga en cuenta que muchos otros diseños de estudio posibles y tratamientos estadísticos son posibles, y el tratamiento de datos y medición debe ser adaptado a los propósitos individuales.

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W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li></ol>

No tengo nada que revelar.

El protocolo general que aquí se presenta ha tenido éxito en la documentación de los efectos fisiológicos después del entrenamiento. Sin embargo, varias zonas de este protocolo están sujetos a modificaciones para adaptarse a las necesidades particulares de experimentación. Por ejemplo, la duración de la formación y el número de ataques podría ser variada para que el programa sea más o menos difícil, según se desee. La altura del recipiente en el que se mide la capacidad geotaxis negativo podría ser alterado para aumentar la superficie disponible para la mejora a ser documentado. Varios métodos de automatización de la cuantificación de la velocidad de ascenso también puede ser aplicable. En principio, cualquier programa de software capaz de distinguir una mosca de fondo puede ser utilizado para acelerar el proceso de recopilación de datos. Algunos aspectos del protocolo sólo debe modificarse con mucha cautela, sin embargo. Por ejemplo, los experimentos preliminares indican fuertemente que al menos un día de descanso por semana tiende a facilitar una mayor improvimiento de ejercicio diario implacable. Además, los ritmos circadianos y la temperatura se sabe que afectan el movimiento de animales de sangre fría. La hora del día que el entrenamiento se lleva a cabo puede variar, pero siempre debe ser coherente dentro de determinados grupos en comparación, con el fin de evitar la posibilidad de efectos de confusión de los ritmos circadianos. El control de temperatura es también esencial, y se recomienda una sala dedicada a temperatura constante a los equipos de ejercicio casa. Por último, los machos y las hembras deben ser criados y miden por separado, con el fin de evitar la posibilidad de efectos de confusión de las diferencias de fertilidad y el sexo en la capacidad de ejercicio. Las posibles aplicaciones de esta metodología sólo están limitadas por la imaginación del investigador. En un trabajo preliminar, hemos utilizado esta metodología en tres aplicaciones principales: <ol><li> Para medir el efecto del ejercicio de resistencia sobre los diversos aspectos de la biología de tipo salvaje a través de las edades. </li><li> To medir el efecto del ejercicio de resistencia en determinados fenotipos mutantes. </li><li> Para detectar los factores genéticos que son necesarios para ejecutar los beneficios del ejercicio </li></ol> Cada una de estas aplicaciones abarca una amplia variedad de posibilidades específicas. Basándonos en nuestra experiencia preliminar, fenotipos mutantes tienden a variar con el nivel de ejercicio tanto como varían con la dieta. El uso de modelos de invertebrados para comprender mejor la relación entre la dieta, el ejercicio y la fisiología del envejecimiento es quizás la aplicación general más importante de este protocolo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Dayton Motorreductor </td><td> Grainger </td><td> 1LRA6A </td><td></td></tr><tr><td> Raco Caja de distribución eléctrica </td><td> Grainger </td><td> 5A052 </td><td></td></tr><tr><td> Raco cubierta </td><td> Grainger </td><td> 5A053 </td><td></td></tr><tr><td> Cooper Bussmann Fusible </td><td> Grainger </td><td> 6F043 </td><td></td></tr><tr><td> Cooper Bussmann Portafusibles </td><td> Grainger </td><td> 1DD33 </td><td></td></tr><tr><td> Carling Technologies Interruptor </td><td> Grainger </td><td> 2X464 </td><td></td></tr><tr><td> Control de Dayton, AC / DC de velocidad </td><td> Grainger </td><td> 4X796 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Flugs con estrechos viales de plástico </td><td> Genesee Científico </td><td> 49-102 </td><td></td></tr></tbody></table>

endurance training protocol and longitudinal performance assays for drosophila melanogaster

Uno de los problemas más apremiantes que enfrentan los investigadores médicos modernos es el repentino aumento de los niveles de obesidad, con el consiguiente aumento en los trastornos asociados, como diabetes y enfermedades cardiovasculares 1-3. Un tema importante de la investigación sobre estos problemas de salud asociados con el papel de los ejercicios de resistencia como una intervención beneficiosa. El ejercicio físico es una manera barata, no invasiva, con la intervención de varios resultados beneficiosos, incluyendo la reducción en el exceso de grasa corporal 4, el aumento de sensibilidad a la insulina en el músculo esquelético 5, el aumento de las respuestas anti-inflamatorias y antioxidantes 6, y aumentar la capacidad contráctil de los cardiomiocitos 7. Ejercicios de baja intensidad se sabe que aumenta la actividad mitocondrial y la biogénesis de los seres humanos y ratones 8, con el coactivador transcripcional PGC1-α como un intermedio importante 9,10. Despíte la importancia del ejercicio como una herramienta para la lucha contra varios importantes relacionados con la edad las enfermedades, extensos estudios genéticos longitudinales se han visto obstaculizados por la falta de un protocolo de entrenamiento de resistencia para una especie de modelo de vida corta genéticos. La variedad de herramientas genéticas disponibles para su uso con Drosophila, junto con su mantenimiento en el corto tiempo de vida y de bajo costo, lo convierten en un modelo atractivo para estudiar más a fondo estos mecanismos genéticos. Con esto en mente, hemos desarrollado un nuevo aparato, conocido como la Torre de Poder, de gran escala de entrenamiento con ejercicios en la Drosophila melanogaster 11. La torre de energía utiliza el comportamiento de las moscas instintiva geotaxis negativo para inducir repetidamente escalada rápida. Cada vez que los ascensores de la máquina, y luego desciende, la plataforma de las moscas, las moscas son inducidos a subir. Las moscas siguen respondiendo siempre y cuando la máquina está en funcionamiento o hasta que llegan a ser demasiado fatigado para responder. Así, el investigador puede utilizar esta máquina para proporcionar sla formación imultaneous a un gran número de moscas de edades similares e idénticas genéticamente. Además, se describen los ensayos asociados útiles para seguir el progreso longitudinal de cohortes de moscas durante el entrenamiento.

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Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

Se presenta el primer protocolo de entrenamiento de resistencia para una especie de modelo genéticos importantes,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Y resumen de varios ensayos para trazar las mejoras en la movilidad de formación siguiente.

Protocolo de entrenamiento de resistencia y ensayos de funcionamiento de los longitudinales de Drosophila melanogaster

One of the most pressing problems facing modern medical researchers is the surging levels of obesity, with the consequent increase in associated disorders ...

endurance-training-protocol-longitudinal-performance-assays-for

Research

JoVE Journal

Biology

Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

15.5K vistas.  University of Michigan Medical School. Se presenta el primer protocolo de entrenamiento de resistencia para una especie de modelo genéticos importantes, Drosophila melanogaster, Y resumen de varios ensayos para trazar las mejoras en la movilidad de formación siguiente.

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High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Vídeo de alta resolución de Seguimiento de la locomoción en adultos de Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Investigación

Biología

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Neurocircuit ensayos para las convulsiones en la epilepsia de los mutantes Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Monitorización de la función del corazón en las larvas Drosophila melanogaster Para los estudios fisiológicos

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

La disección de Oenocytes de Adultos Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Comparación cuantitativa de Cis-Elemento regulador (CRE) Las actividades de transgénicos Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Medición de la esperanza de vida en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

El mantenimiento de una<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Jaula Población

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...