Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de neurociencia sobre cómo se produce el transporte del sustrato de transducción de señales y un aclaramiento de residuos en los espacios extracelulares cerebrales. La principal ventaja de esta técnica es que permite el muestreo y cuantificación de grandes moléculas extracelulares en el fluido intersticial o ISF de animales despiertos que se mueven libremente. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, retire el cabello del cráneo de un ratón anestesiado y utilice las barras de las orejas y una abrazadera nasal para fijar el animal de forma segura en un adaptador.
Aplique un ung ón en los ojos del animal y coloque el adaptador sobre el aparato estereotaxico. Utilice un bisturí para hacer una incisión de la piel sagittally sobre el cráneo y adjunte un taladro en el manipulador del marco estereotaxico. Baje el taladro hasta que toque suavemente lambda y restablezca la coordenada DV del taladro a cero.
Entonces, mueva el taladro al bregma para reajustar las coordenadas AP y ML a cero. Mueva el taladro de bregma a la coordenada vertical. Baje el taladro al cráneo y establezca la coordenada DV en cero de nuevo.
Después de repetir el procedimiento para una tercera coordenada, taladre cuidadosamente un agujero de rebaba en la coordenada de destino, seguido de un segundo agujero en el lado contralateral del hueso parietal. Inserte un tornillo óseo en el segundo orificio y coloque la pieza de bloqueo de una tapa de tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros en el cráneo para que los orificios de la rebaba estén dentro del círculo. A continuación, coloque una cánula guía en el brazo más corto del adaptador estereotaxico y fije la cánula con una tuerca de tapa.
Coloque el brazo más largo del adaptador estereotaxico en la abrazadera del electrodo y conecte el brazo en el manipulador del aparato estereotaxico. Gire el conjunto estereotaxico DV en el brazo manipulador 12 grados y mueva la cánula guía al orificio de la rebaba. Luego, baje lentamente la cánula guía 1.2 milímetros en el cerebro.
Agregue cemento dental a la corona hasta que la parte metálica de la cánula guía, el tornillo óseo y cualquier cráneo expuesto estén cubiertos y asegurados y deje que el cemento se seque. Después de 12 a 20 minutos, retire el adaptador estereotaxico de la abrazadera del electrodo, retire la tuerca de la tapa y reemplace el adaptador estereotaxico por una sonda ficticia. A continuación, vuelva a sujetar la tuerca de la tapa, suelte el ratón del aparato estereotaxico y alberge al ratón solo en una jaula individual.
Antes de configurar la microdiálisis, llene una jeringa desechable de un mililitro con agua destilada y utilice un tubo de vin viton para conectar la jeringa a la salida de una sonda de microdiálisis. Cubra manualmente los orificios de ventilación y presione suavemente el émbolo de la jeringa para infundir agua la sonda. Confirme que el agua aparece en la entrada de la sonda y que hay fugas en la superficie de la membrana de microdiálisis.
Para activar la sonda, sumerja las membranas de la sonda en 70-100%etanol durante dos segundos, seguido de una segunda infusión de agua destilada. Conecte una aguja de conexión a una entrada y una línea de salida y cargue una jeringa desechable de tres mililitros con tampón de perfusión recién preparado. Conecte una jeringa equipada con una aguja de extremo romo al extremo de entrada del tubo y utilice una bomba de jeringa para llenar todo el tubo con tampón de perfusión.
Cuando el tubo esté lleno, sustituya la aguja de conexión entre las líneas de entrada y salida por la sonda de microdiálisis activada y la tuerca de la tapa y monte un tubo de rodillos en el tubo de salida de una bomba de rodillos. Arranque la bomba de la jeringa a 10 microlitros por minuto y la bomba de rodillos a 9,5-9,8 microlitros por minuto. Ahora coloque el collar alrededor del cuello del animal implantado de la cánula guía anestesiada y retire la tuerca de la tapa y la sonda ficticia.
Inserte lentamente la sonda de microdiálisis a través de la cánula guía y fije la tuerca de la tapa. A continuación, coloque el ratón en una jaula conectada a un sistema de movimiento libre y ate el ratón con el collar. Después de al menos una hora, detenga secuencialmente la bomba de rodillos y la bomba de la jeringa, reiniciando las bombas con la bomba de jeringa ajustada a un 20% más rápido que la bomba de rodillos y coloque el extremo libre del tubo de salida en un colector de fracción refrigerado para recoger el ISF cerebral.
Cuando se haya obtenido el volumen experimental adecuado, quite la sonda y controle la recuperación del mouse como se acaba de demostrar. De acuerdo con observaciones anteriores, cuando se administran 50 micromolares Picrotoxina a través de la microdiálisis inversa como se ha demostrado en ratones C57B6J despiertos, se observa un aumento de los niveles intersticiales de tau endógeno en comparación con los niveles medidos en animales tratados con un control vehicular. Además de las administraciones de medicamentos, la microdiálisis se puede combinar con otros métodos in vivo como el registro de EEG u optogenética para responder preguntas adicionales sobre cómo la actividad neuronal influye en la concentración de sustrato en la ISF.
