Este método proporciona una herramienta importante en el campo de la modificación de proteínas, permitiendo la generación fácil y eficiente de conjugados de fármacos de anticuerpos. Las principales ventajas de esta técnica son la facilidad de manejo, el alto rendimiento de la producción de anticuerpos, la velocidad de la reacción psicodesión y la estabilidad del enlace formado. Comience este procedimiento con el crecimiento de las celdas de suspensión HEK como se describe en el protocolo de texto.
Cuando se alcance la densidad de 2,5 millones de células por mililitro, prepare una solución fresca del derivado del ciclopropeno de lisina, o CpK, en 1 hidróxido de sodio molar. Añadir 2,5 mililitros de CpK al medio de expresión complementado con antibióticos. Mezclar bien la solución y añadir 250 microlitros de un HCl molar, luego esterilizar la solución usando un filtro de 22 micras.
Ahora centrifugar 125 millones de células en la densidad objetivo durante cinco minutos a 500 g. Después de la centrifugación, agregue la mezcla de reactivo de transfección de ADN al medio de expresión que contiene CpK y utilice este medio para resuspend las células. De seis a siete días después de la adición de CpK, cosecha los anticuerpos CpK de trastuzumab que llevan del sobrenadante centrifugando las células durante 15 minutos a 3.000 x g.
A continuación, filtre el sobrenadante. Ahora agregue 5x tampón de lavado de cuentas en tubos cónicos de 250 mililitros y mezcle con el sobrenadante y agregue la proteína preequilibrada A resina. Coloque el tubo cónico en un rodillo durante tres horas a temperatura ambiente para bajar el anticuerpo y el sobrenadante.
Después de la incubación, transfiera la proteína Una resina con el sobrenadante en una columna y permita que el líquido fluya a través. A continuación, agregue 25 mililitros de tampón de lavado y deje que fluya a través. Añadir un mililitro de un tampón de fosfato molar, 150 cloruros de sodio militrolares al tubo de recogida y eluir el anticuerpo con cuatro mililitros de 1 citrato de sodio molar pH 3.
La solución ácida se neutraliza inmediatamente a medida que sale de la columna por la solución básica ya presente en el tubo de recogida. A continuación, diluir el anticuerpo con 10 mililitros de PBS. Concentrar el anticuerpo a 5 a uno mililitros por filtración centrífuga e intercambiar el buffer tres veces con PBS.
Purifique las muestras por FPLC utilizando una columna de interacción hidrofóbica de butilo con un gradiente de cero a 100% de tampón de sal baja en tampón de sal alta durante 30 minutos. Recoger todas las fracciones y monitorear la elución a 280 nanómetros. Concentrar las fracciones que contienen anticuerpos por filtración centrífuga e intercambiar el buffer tres veces con PBS.
El anticuerpo se puede almacenar a cuatro grados centígrados. Monomethyl auristatina E, o MMAE, es altamente tóxico. Por lo tanto, utilice guantes y gafas al manipular derivados de MMAE.
Si utiliza MMAE sin modificar como control, manipule el producto sólido dentro de una campana de humos al preparar la solución de stock en el MSO. Para conjugar el anticuerpo con la molécula de rodamiento de tetrazina, diluir 10 equivalencia molar de MMAE de tetrazina por anticuerpo con 20 microlitros de acetonitrilo y 76 microlitros de PBS en un pequeño tubo cónico. Añadir un equivalente molar de trastuzumab con CPK.
Mezclar bien y dejar reaccionar durante tres horas a temperatura ambiente para formar trastuzumab vinculado a MMAE. Las moléculas distintas de MMAE potencialmente más grandes y más obstaculizadas ísticamente pueden vincularse al anticuerpo utilizando este protocolo. Agregue todo el volumen de la reacción a la columna de giro y centrifugar a 1500 x g durante un minuto.
Para analizar el conjugado, equilibre la columna HPLC HIC con un tampón de sal 100% alto durante cinco minutos. A continuación, mezcle 15 microlitros de una solución de un miligramo por mililitro de trastuzumab vinculada a MMAE con 15 microlitros de 2x de tampón alto de sal en un vial. Inyecte la mezcla en la columna HPLC.
Elute en un flujo isocrático de un mililitro por minuto con un tampón de sal 100% alto durante un minuto. Siga esto con un gradiente de 15 minutos de 100 a cero por ciento de tampón de sal alta en tampón de sal baja. Monitoree la elución a 280 nanómetros.
Integre los picos en el cromatograma con tiempos de retención de 7,5, 9,2 y 11,5 minutos, que corresponden a trastuzumab con cero, una y dos toxinas conjugadas, respectivamente. Ahora, calcule el DAR sumando las áreas de los picos en 9,2 minutos, que tiene un peso de uno, y 10,5 minutos, que tiene un peso de dos, y divida por el área total de los tres picos. Para analizar el conjugado por LC-MS, en primer lugar, deglicecilación 30 microlitros de un miligramo por mililitro ADC y el anticuerpo no modificado en condiciones no reductoras utilizando 250 unidades de PNGase F durante al menos seis horas a 37 grados Centígrados.
Descongelar el suero y filtrarlo a través de un filtro de 22 micras. A continuación, llene los pozos externos de una placa de 96 pozos con agua. En los pozos centrales, mezclar en triplicado 90 microlitros de suero con 10 microlitros de un miligramo por mililitro trastuzumab tetramethylrhodamine en PBS a una concentración final de 1 miligramo por mililitro.
Coloque la placa en una incubadora saturada de humedad a 37 grados centígrados y cuatro por ciento de CO2. Cada 24 horas a lo largo de cinco días, pipetear cada pozo a fondo para mezclar y tomar una alícuota de cinco microlitr. Flash congelar la alícuota con nitrógeno líquido y almacenar a 80 grados Celsius.
Una vez recogidas todas las muestras, descongelar las alícuotas y analizar utilizando un ELISA indirecto, como se detalla en el protocolo de texto. Alternativamente, se puede utilizar un kit ELISA comercial para medir la concentración del ADC. Dos días antes del ensayo, llenar los pozos exteriores de una placa de 96 pozos con agua.
Luego levante las células con 05%trysina en EDTA de 5 milimolares. Centrifugar las células tres minutos a 250 x g y resuspend en nuevo medio. Luego sembrar 3.000 células en 100 microlitros por pozo en 96 placas de pozo y colocarlas de nuevo en la incubadora.
Dos días después de sembrar las células, preparar diluciones en serie de todas las muestras en triplicado con 1%DMSO en medio completo. Ahora agregue 100 microlitros de cada muestra en cada pozo e incubar durante cinco días a 37 grados centígrados y cuatro por ciento de CO2. En el día cinco, mida la viabilidad celular.
Con este fin, utilice un kit comercial para ansimiento de las células y medir el ATP liberado. Trazar el porcentaje de señal con respecto a las células de control tratadas con 1%DMSO. Los ADC se pueden incubar a 37 grados centígrados durante cinco días en suero y se pueden ensayo para que la citotoxicidad demuestre estabilidad funcional.
Un anticuerpo con un mango de ciclopropeno se puede obtener utilizando este procedimiento con rendimientos superiores a 20 miligramos por litro después de la purificación de la proteína A. El anticuerpo producido puede conjugarse rápidamente y específicamente en el sitio con una toxina que lleva una tetrazina. Tras la conjugación del anticuerpo con una toxina, las proporciones medias de fármaco a anticuerpos son superiores a 1,9, medidas por cromatografía de interacción hidrófoba.
La identidad del ADC se confirma mediante espectrometría de masas. El enlace de dihirridizena generado es estable en suero humano durante más de cinco días a 37 grados Celsius. El conjugado de anticuerpos es potente y mata selectivamente las células con altos niveles de HER2, en lugar de células con niveles bajos de HER2.
Además, el anticuerpo sin la toxina y la toxina modificada con el eslabón de tetrazina tienen muy baja toxicidad. La toxina por sí sola muestra una toxicidad no dependiente de HER2 que destaca la necesidad de focalización para lograr la selectividad. Después de este procedimiento, podemos preparar rápida y eficientemente conjugados de fármacos de anticuerpos para el tratamiento de tumores.
Potencialmente, cualquier fármaco funcionalizado con una tetrazina puede estar relacionado con cualquier anticuerpo dirigido a un biomarcador de células cancerosas. Las implicaciones de esta técnica se extienden a cualquier conjugado proteico destinado a la terapia o diagnóstico.
