El objetivo general de este procedimiento es producir una vacuna de glicoconjugado homogénea mediante la combinación de la incorporación de aminoácidos no canónicos y la química de clics. La expansión del código genético es una poderosa herramienta para incorporar aminoácidos no naturales en las proteínas para modificar sus características, estudiar o crear nuevas funciones proteicas, o tener acceso a conjugados proteicos. Un método de supresión de codón ha surgido como el método más popular para incorporar aminoácidos antinaturales en diferentes posiciones.
Esta metodología se aplicará aquí a la producción de un portador de proteínas que contenga un aminoácido antinatural que alberga un grupo funcional bioortohogonal. Este mango reactivo se puede utilizar a continuación para injertar de forma específica y eficiente un hapten sintético de oligosacárido para proporcionar una vacuna de glicoconjugado homogénea. La propargil-lisina, PrK, se sintetiza en dos pasos de Boc-lisina comercial.
En el primer paso, el grupo amino desprotegido de la Boc-lisina se convierte en cloroformato propargyl. En un segundo paso, el grupo de aminoácidos alfa está desprotegidos. Para sintetizar el N(alfa)Boc-propargyl-lisine, primero disolver 500 miligramos de boc-lisina en la mezcla de cinco mililitros de un molar acuoso NaOH y cinco mililitros de THF en un matraz y encajar el matraz con un tabique de silicio.
Enfríe el matraz en un baño de hielo y espere a que se disuelva el polvo. A continuación, agregue el propargyl chloroformate drop-wise durante un período de dos a tres minutos bajo agitación. Caliente la mezcla de reacción a temperatura ambiente y continúe revolviendo durante 10 horas.
Enfriar las soluciones de éter dietílico, ácido clorhídrico molar acuoso y acetato de etilo. Enfríe la mezcla de reacción bruta en un baño de hielo. Vierta la mezcla en un embudo separador.
Extraiga una mezcla con cincuenta mililitros de éter dietílico. La extracción puede resultar en una acumulación de presión, asegúrese de liberar cualquier acumulación de presión con frecuencia. Recoger la fase acuosa y descartar la capa orgánica.
Añadir con cautela, cincuenta mililitros de un ácido clorhídrico molar a la fase acuosa en el embudo separador. Luego, extrae la capa acuosa dos veces usando treinta mililitros de acetato de etilo. Recoger la fase orgánica, Verificar la presencia de su compuesto por TLC.
En esta etapa, debe estar en la fase orgánica. Seque las capas orgánicas combinadas sobre el sulfato de magnesio. Filtrar la fase sólida.
Y concentrar el filtrado bajo presión reducida en un evaporador rotatorio. Disolver la muestra del N(alfa)Boc-propargyl-lisina aceiteh crudo en cloroformo deuterated y controlar su identidad por RMN. Para sintetizar el propargyl-L-lisine, introducir el N(alpha)Boc-propargyl-lisine en un matraz de botón redondo equipado con un tabique.
Añadir cuatro mililitros de diclorometano anhidro en el matraz bajo el argón. Agregue cuatro mililitros de ácido trifluoroacético en la agitación. Reemplace el tabique de silicio por una tapa de vidrio para evitar que TFA dañe el tabique de silicio.
Revuelva la mezcla de reacción durante una hora a temperatura ambiente. Verifique la desprotección del Boc-PrK por TLC. Concentrar la mezcla de reacción bajo presión reducida.
Añadir éter de dietil al residuo crudo. Filtrar el propargyl-L-lisina en forma de un sólido blanco sobre un vidrio frito. Disolver una alícuota de la propargyl-L-lisina en óxido de deuterio, luego llevar a cabo el análisis de RMN para controlar su identidad y pureza.
Propargyl-L-lisina se disuelve en agua destilada a la concentración final de cien mililitros y se almacena a menos 20 grados en alícuotas de un mililitro. Para co-transformar plásmidos en la cepa de expresión, descongele un centenar de microlitros alícuotas de E. coli BL21 químicamente competente sobre hielo durante cinco minutos. Añadir un microlitro de cada plásmido o cincuenta a cien nanogramos de cada uno en las células e incubarlos durante 30 minutos en hielo.
Incubar las células competentes a 42 grados, durante 45 segundos. Luego, ponlos de nuevo en hielo durante dos minutos. Añadir novecientos microlitros de LB medio e incubar bajo agitación durante una hora a 37 grados para permitir la expresión de antibióticos.
A continuación, placar las bacterias transformadas en el agar LB con antibióticos. Permita que las bacterias crezcan durante la noche a 37 grados. Para expresar proteínas modificadas con PrK, inocular una sola colonia co-transformada en cinco mililitros de medio LB con antibióticos.
Incubar durante la noche a 37 grados con temblores. Al día siguiente, diluir con los cinco mililitros de cultivo primario en quinientos mililitros de medio de auto-inducción que contienen antibióticos, 0.02% de L-arabinosa, y un milimolar de PrK e incubar a 37 grados durante 24 horas bajo temblor. Incluir un control negativo mediante la realización de la cultura sin PrK y el control positivo mediante la realización de la cultura de un clon que contiene el gen proteico de tipo salvaje.
Cosecha las células del cultivo nocturno por centrifugación a 5.000 x g durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y congele el pellet a menos 20 grados. Para la purificación de la proteína por cromatografía de afinidad de banco de flujo de gravedad, resuspendir los gránulos celulares en veinte mililitros de tampón de lelisis.
Añadir DNase I y la lesozima, y permitir la lelisis incubando la suspensión a 37 grados durante 30 minutos. Sonicar las células en hielo durante cinco minutos, luego retirar los desechos celulares por centrifugación a 20.000 x g durante 30 minutos. Filtrar el izado con filtro de 0,45 micrómetros Añadir resina Ni-NTA a la suspensión.
Se mezcla suavemente a cuatro grados durante una hora. Vierta la suspensión en una columna de polipropileno y recoja la fracción sin enlazar. Lavar la resina con diez mililitros y luego cinco mililitros de tampón de lavado.
Recoger las fracciones de lavado. Eluir la proteína su-etiquetada con un milímetro de tampón de elución y repetir este paso cuatro veces y recoger todas las fracciones adicionales. Combine las fracciones que contienen proteínas puras etiquetadas con histidina y dialícela en un litro de tampón de proteasa TEV durante la noche mediante el uso de membrana de diálisis.
Recoger la muestra de proteína en un tubo de 50 mililitros y añadir tampón TEV para obtener una concentración final de dos miligramos por mililitro en un volumen final de un mililitro. Añadir cien microlitros de TEV proteasa. Añadir 50 microlitros de 0,1 TDT molar.
Completo con búfer TEV de hasta cinco mililitros. Incubar durante la noche a cuatro grados, con temblor lento. Para eliminar el EDTA, dializar la proteína a cuatro grados durante la noche mediante el uso de membrana de diálisis y tampón de fosfato con cinco imidazol mililolar.
Para eliminar la proteasa del TEV y las proteínas no digeridos, incubar la mezcla con cuentas de Ni-NTA y mezclar suavemente durante una hora a cuatro grados. Vierta la suspensión en una columna de polipropileno. Recolectó la fracción sin enlazar.
La proteasa del TEV y las proteínas no digeridas permanecen unidas a las cuentas y la proteína digerida se elue. Lave la columna con cinco mililitros de tampón de lavado y recoja también las fracciones de lavado. Dialyze la proteína digerida contra un litro de tampón de clic a cuatro grados durante la noche con membrana de diálisis para eliminar el imidazol, así como para intercambiar el tampón.
Y medir la concentración de la proteína a 280 nanómetros. Para conjugar el mPsaA con 6-hexacloro-fluoresceína-azida, o un antígeno de carbohidratos funcionalizado por antídoto, ponga la proteína mutada PrK a una concentración de 57,8 micromolares en un micro tube de dos mililitros. Añadir 10 microlitros de cinco compuestos de azida milimolar, luego añadir una premezcla de solución de sulfato de cobre y THPTA.
Añadir clorhidrato de aminoguanidina. Añadir solución acuosa preparada extemporáneamente de ascorbato sódico. Cierre el tubo, mezcle invirtiendo varias veces e incubar a temperatura ambiente durante dos horas.
Detenga la reacción añadiendo EDTA. Compruebe la conjugación en la página SDS. Después de la migración, visualice el gel sobre la luz UV a 312 nanómetros para el conjugado con fluoresceína.
O tiñe el gel con Coomassie Blue para visualizar el conjugado con el antígeno de carbohidratos. Como adición del hapten debe inducir un cambio de peso molecular. Purificar el glucoconjugado aplicándolo en una columna de filtración de gel equilibrada con PBS.
Recoger las fracciones que contienen los glucoconjugados. Para un almacenamiento prolongado, dializa el glucoconjugado contra el agua destilada, luego se seca y almacena el glucoconjugado a menos 80 grados. El PrK se ha introducido en la posición 32 en sustitución de una lisina cerca de la N-terminus de la PsaA.
La eficacia de la producción de mPsaA ha sido comprobada por la página SDS y el análisis de Western blot utilizando anticuerpos antihistidina. La presencia de una proteína de longitud completa indica fuertemente la incorporación exitosa del PrK. La intensidad es, sin embargo, menor que la observada para mPsaA de tipo salvaje.
El mPsaA(K32PrK) ha sido purificado en cuentas Ni-NTA. Con un rendimiento típico de ocho miligramos y la incorporación del residuo PrK fue finalmente confirmada por espectrometría de masas. La etiqueta de histidina se eliminó al escote proteolítico usando la proteasa TEV.
Tener el mPsaA(K32PrK)la reactividad de la alquina se evaluó utilizando una fluoresceína azido-funcionalizada y se utilizó además para conjugar un antígeno sintético de oligosacárido. Los experimentos se realizaron en comparación con mPsaA de tipo salvaje como control. Finalmente, el glucoconjugate fue purificado por filtración de gel y su identidad confirmada por espectrometría de masas.
En este proyecto, se han preparado vacunas homogéneas de glucoconjugado utilizando la tecnología de supresión de codón de parada de ámbar para incorporar un aminoácido no natural bajo sitios definidos. La homogeneidad de la vacuna glucoconjugada es un criterio importante para garantizar una caracterización fisicoquímica completa. Y así, satisfacer las recomendaciones cada vez más exigentes de las agencias de drogas.
Este criterio no se cumple utilizando el método clásico de conjugación pura. Además, este protocolo permite ajustar con precisión la estructura de la vacuna contra el glucoconjugado. Dando lugar a una herramienta sin precedentes para estudiar la relación entre la homogeneidad y la estructura de un glucoconjugado.
