Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioquímica como el tamaño, la forma y los cambios conformacionales de las biomoléculas y sus complejos. La principal ventaja de esta técnica es que los experimentos se pueden realizar en condiciones de amortiguación fisiológicamente relevantes en un entorno donde las biomoléculas son estables. SAXS es una técnica complimentary para muchos otros métodos de biología biofísica y estructural.
La combinación de SAXS con estos métodos puede ayudarnos a desarrollar terapias basadas en la estructura. Aunque este método puede proporcionar información sobre los complejos biomoleculares, también se puede aplicar a otros sistemas como el estudio de nanopartidistas y versículas de administración de fármacos. Generalmente, los individuos nuevos en este método tendrán problemas porque aparece como un proceso abrumador y complicado, para pasar de datos de dispersión sin procesar a estructuras de baja resolución.
La demostración visual de este método es crítica ya que la canalización del análisis de datos para obtener modelos estructurales a partir de datos sin procesar es difícil de aprender porque implica el uso de muchos paquetes diferentes de software. Hay algunos paquetes de software que son útiles para el análisis de datos SAXS. Estos incluyen SCATTER, BioXTAS RAW y la suite ATSAS.
En este vídeo, proporcionaremos una visión general de los pasos generales a seguir al analizar datos SAXS sin procesar, utilizando el conjunto de programas ATSAS. Para comenzar, instale y cargue el conjunto de programas ATSAS. Abra el programa PRIMUS/Qt y vaya a la opción Abrir menú.
Aquí, seleccione hasta 13 archivos de datos de interés. Los archivos de datos deben estar en el formato ASCII, en el que la primera columna es el eje s-vector y la segunda columna es la intensidad. Repita este paso para los datos de solo búfer, insertando estos datos en un segundo menú Herramientas.
A continuación, vaya a la ventana Procesamiento de datos y seleccione Restar. Esto generará una curva de dispersión restada, que representa sólo la dispersión de la macromolécula de interés. Para realizar el análisis de Guinier, comience con una curva de dispersión restada de búfer cargada en PRIMUS/Qt.
A continuación, haga clic en Radio de giro, que abrirá el Mago Primus Guinier. En este punto, se mostrará un gráfico que muestra el registro natural de los ángulos de intensidad frente a los ángulos de dispersión al cuadrado. Para obtener un radio preliminar de giro, busque la ventana Símbolo del sistema y utilice la función Autorg.
Después de presionar Autorg, haga clic en el límite superior hacia arriba uno, luego hacia abajo uno para forzar el programa a actualizar las mediciones estadísticas. Como alternativa, introduzca varios archivos a la vez haciendo clic en el mismo símbolo del sistema abierto y seleccionando varios nombres de archivos de datos resaltándolos de la misma manera que se describió anteriormente. Para comenzar el análisis Kratky, haga clic para seleccionar el nombre del archivo de datos.
Esto trazará los datos en la ventana. Y luego, seleccione Trazar. A continuación, debajo del botón Trazar, haga clic en Gráfica Kratky.
Como resultado, las proteínas globulares muestran un pico GALC-ean, mientras que las proteínas desplegadas mostrarán una meseta en lugar de un pico y se asemejarán a una gráfica hiperbólica como la que se muestra aquí. Cargar datos restados de búfer para cada concentración en PRIMUS/Qt una vez más. Y en la pestaña Procesamiento, haga clic en Escalar e inspeccionar cada curva y el número de escala i, que se correlaciona con las diluciones realizadas a partir de la muestra original.
Después de la inspección, combine los datos haciendo clic en el botón Combinar de la ventana Procesamiento. Para generar el trazado de distribución de distancia, cargue las curvas de datos combinadas en PRIMUS/Qt y, a continuación, haga clic en Distribución de distancia en la ficha Análisis. Ajuste el rango de datos de los datos combinados para evitar cualquier ruido significativo en el extremo final de los datos sin procesar.
Además, omita los puntos de datos cerca de la parada de haz en la región de baja q seleccionando el valor de rango inferior y aumentando el número. Para determinar el Dmax, comience con un rango de cinco veces el radio de giro obtenido del análisis guinier. A continuación, disminuya gradualmente este valor hasta que la gráfica de distribución de distancia no caiga abruptamente a cero en el eje Y y no tenga una cola larga antes de acercarse a cero.
Compruebe que el radio experimental de giro frente a la gráfica de intensidad, que se deriva de la aproximación guinier y el radio de distribución de distancia de giro frente a números de intensidad son similares. Aquí, la intensidad de la luz dispersa se muestra trazada contra el ángulo de dispersión, sugiriendo tanto la calidad de las biomoléculas nidogen-1, laminin gamma-1 y su complejo, así como su forma. La distribución de la distancia del par de electrones determinada a partir de los datos de dispersión sugiere que las biomoléculas tienen una forma alargada y la gráfica Kratky sugiere que las proteínas están en un estado plegado, ya que los datos tienden a meseta, o incluso aumentan en el rango q más grande y carecen de una forma de curva de campana.
Además, las gráficas guinier, que utilizan datos en ángulo de dispersión bajo, indican la región lineal para la determinación del radio de giro, que se muestra aquí para nidogen-1, laminin gamma-1 y su complejo. Para estudiar los complejos proteína-proteína, MONSA se utilizó para obtener la estructura de baja resolución de todo el complejo gamma-1 de lainina nidogen-1, lo que sugiere que sólo la región C-terminal de ambas proteínas participa en interacciones mediadoras, mientras que el resto de los dominios están muy separados entre sí. No olvide que trabajar con radiación sincrotrón puede ser extremadamente peligroso y las precauciones y la seguridad descritas por cada línea de haz diferente siempre deben tomarse mientras se realiza la recopilación de datos inicial.
