SEC-MALS es un método cuantitativo para determinar el peso molecular, el tamaño y la conformación de las macromoléculas en solución. Puede identificar oligómeros y complejos, y caracterizar muestras difíciles, como glicoproteínas y proteínas de membrana. SEC-MALS es un método absoluto.
Se basa en la física fundamental, y no depende de la colaboración contra los estándares moleculares, la conformación de la molécula, o cómo interactuamos con el medio de separación. SEC-MALS se puede aplicar a muchos sistemas separados por seg. Desde péptidos y polímeros pequeños hasta proteínas, nucleócidos, polisacáridos, polímeros sintéticos, partículas similares a virus y virus pequeños.
Es importante comprobar que el sistema y los búferes no se han hecho las recomendaciones del proveedor para el contenido de partículas baja. Consulte con el representante de soporte técnico del proveedor para estar seguro. Comience este procedimiento con la preparación del sistema SEC-MALS como se describe en el protocolo de texto.
Usando cada reactivo de grado PLC, prepare un litro de solución salina tamponada con fosfato con cloruro de sodio de 50 a 100 mililitros. Filtre el tampón a 0,1 micras con un filtro de espuma de células de poliéter embotellado o similar. Filtrar los primeros 50 a 100 mililitros de tampón a una botella de desecho para eliminar las partículas de los filtros secos.
A continuación, filtre el resto a una botella limpia y estéril que haya sido lavada previamente con agua filtrada y desionizada y evitada para evitar que entre polvo. Enjuague la columna durante la noche a un caudal de 0,5 mililitros por minuto para equilibrar la columna en el búfer y eliminar partículas. Utilice el modo de flujo continuo del FPLC y asegúrese de que el flujo no se detenga hasta que se completen todas las ejecuciones SEC-MALS.
Coloque la celda de flujo DRI en modo de purga durante el vaciado nocturno. Al iniciar el lavado, aumente gradualmente el caudal para evitar el efecto de desprendimiento de columnas, causado por un cambio repentino de presión en la columna. Desactive la purga antes de comenzar las ejecuciones de muestra.
Compruebe la limpieza del sistema tocando ligeramente el tubo aguas abajo de la columna para liberar las partículas acumuladas. Observe la señal en el detector de 90 grados en la pantalla del panel frontal del instrumento MALS. Verifique que el ruido pico-pico no sea más de 50-100 microvoltas.
Compruebe también que el índice de refracción, o señal RI, es estable a menos de 1 veces diez a las menos siete unidades de índice de refracción. Realice una inyección en blanco para verificar que el inyector está limpio de partículas. Un espacio en blanco es simplemente el tampón de funcionamiento preparado en un vial fresco y estéril.
Si el pico de partícula no tiene más de un mililitro de volumen y no más de cinco milivoltios por encima de la línea de base, entonces el sistema está listo para las muestras. De lo contrario, realice inyecciones en blanco adicionales hasta que estén limpias o realice tareas de mantenimiento para limpiar el inyector. Ahora, prepare al menos 200 microlitros de BSA a uno a dos miligramos por mililitro en el búfer SCC.
Filtrar la proteína a 02 micras, utilizando un filtro de punta de jeringa. Deseche las primeras gotas de filtrado, con el fin de eliminar las partículas de los filtros secos. Alternativamente, centrifugar la muestra a 10.000 veces G durante quince minutos para permitir la precipitación de agregados no solubles y otras partículas grandes.
A continuación, inyecte 100 microlitros de la solución BSA en el bucle. Abra un nuevo experimento desde el método en el menú del software MALS. A continuación, seleccione el método en línea en la carpeta de métodos del sistema de dispersión de luz.
Si hay un detector DLS, seleccione el método en línea de la dispersión de luz con la carpeta QELS. Establezca los parámetros de la fase de ejemplo y móvil en la sección de configuración. En la vista de bomba genérica, establezca el caudal en el utilizado en el FPLC.
A continuación, vaya a la vista de bomba genérica, rama de disolvente, campo de nombre y seleccione PBS. En la vista del inyector, rama de ejemplo, escriba el nombre como BSA. Establezca dn/dc en 0.185, establezca A2 en 0 y establezca el Coeficiente de Extinción UV en 0.667 mililitros por centímetro de miligramo.
En la sección de procedimientos, vista de colección básica, seleccione el desencadenador de casilla de verificación en la inyección automática. Establezca la duración de la ejecución en 70 minutos, de modo que se recopilen datos para toda la alusión, hasta que se alcance el volumen de permeación total de la columna SEC. Inicie el experimento en el software MALS haciendo clic en el botón Ejecutar.
Comenzará a leer los datos después de recibir la señal de pulso del instrumento FPLC a través del detector MALS. Cero la señal DRI haciendo clic en el botón de cero automático en el panel frontal del instrumento. Trabajando en el software FPLC, vaya a manual, ejecute instrucciones manuales, establezca la marca e inserte el nombre de la proteína y la ejecución.
Cambie la válvula de inyección de la carga manual para inyectar, debajo de la trayectoria de flujo, la válvula de inyección. Incluya una señal de pulso insertando un pulso de 0,5 segundos bajo la caja de E/S pulso digital hacia fuera. Esto desencadenará la recopilación de datos en el software MALS.
Ahora, inyecte la muestra en el bucle. Haga clic en ejecutar en el software FPLC para iniciar la ejecución del experimento. Realice el análisis paso a paso, bajo la sección de procedimientos en el software MALS.
Compruebe que los picos aparecen aproximadamente en el mismo volumen de alusión en UV, MALS y RI comprobando la vista de recopilación básica. En la vista de línea base, defina la línea base para todas las señales. En la vista de picos, defina los picos que se analizarán haciendo clic y arrastrando el ratón.
Seleccione el 50% central de cada pico. Primero seleccione el pico del monómero y, a continuación, el pico de dimer. Bajo cada pico, verifique los valores correctos de dn/dc y el coeficiente de extinción en 280 nanómetros para BSA.
En la vista de alineación de procedimientos, seleccione la región central de los picos haciendo clic y arrastrando el ratón. Haga clic en Alinear señales y, a continuación, en Aceptar. En los procedimientos, vista de ampliación de banda, elija el 50% central del pico monómero.
Asegúrese de que el detector de índice de refracción se especifica como instrumento de referencia. A continuación, haga clic en realizar ajuste y aplique para que coincida con las señales de dispersión UV y luz a la señal de índice de refracción. Zoom en los picos para verificar que se superponen muy de cerca dentro de la central 50 a 70% y luego haga clic en OK.
En los procedimientos, vista de normalización, seleccione el pico uno. Escriba 3,0 nanómetros como valor RG, haga clic en normalizar y, a continuación, haga clic en Aceptar. Vea el gráfico de los resultados en la vista de gráfico EASI.
Seleccione la masa molar en el menú desplegable de visualización en la parte superior de la ventana. Utilice el control, haga clic y arrastre para acercar la región de pico. Para ver los resultados de masa molar promedio de peso tabulado final para los picos de monómero y dimer, desplácese hasta los resultados máximos, los momentos de masa molar, MW y seleccione los resultados, informe resumen.
La pureza se reporta bajo los resultados máximos, fracción de masa. En el menú de archivos, seleccione Guardar como método y guarde los datos BSA analizados como un método estándar para mediciones futuras de todos los tipos de proteínas. Los parámetros de normalización y ampliación de banda determinados para BSA se transferirán en el análisis.
Aquí se muestran los análisis SEC-MALS de BSA, utilizando una columna de exclusión de tamaño de poro de 200 Angstrom. Las trazas de cromatograma se normalizan al pico del monómero y se compensan para mayor claridad. Se señalan artefactos comunes que pueden ser ignorados, incluyendo un pico de partícula cerca del comienzo de la señal de dispersión de luz, así como picos de sal y aire disuelto cerca del volumen total de permeación en la señal del índice de refracción.
El cromatograma exhibe una excelente separación monomerímero-dimer-trimer, y la señal de dispersión de luz exhibe una señal alta al ruido. Los valores de masa molar promedio de peso monómero y dimer presentan una alta homogeneidad. Estos son ejemplos de análisis SEC-MALS de baja calidad.
En este ejemplo, la separación inadecuada en una columna de exclusión del tamaño de los poros de 75 Angstrom da como resultado un pico de partícula entre ocho y nueve minutos, que no está bien separado de las proteínas. Aquí, hay una relación señal-ruido inadecuada, y las partículas extensas adyacentes a las proteínas son evidentes en la señal de dispersión de la luz. Las claves para obtener buenos resultados de SEC-MALS son seleccionar una columna adecuada, asegurarse de que el sistema está calibrado con bajo ruido de dispersión de luz, y prefiltrar o centrifugar las muestras para eliminar partículas.
Después de SEC-MALS, las muestras de proteínas se pueden analizar más a fondo para la afinidad de unión, bioliza, resonancia de plasma superficial, calorimetría de valoración isotérmica, forometría biolerida, termoforesis a microescala, o gradiente de composición, dispersión de luz multiángulo. La estructura proteica puede determinarse mediante cristalografía de rayos X, malacroscopia crioelectrón o RMN.
