Este método puede ayudar a responder a preguntas clave en el área de la administración de medicamentos, como cómo entregar un medicamento a un granular celular específico. La principal ventaja de esta técnica es que la translocación nuclear del gas puede ser inducida por la luz. Demostrando el procedimiento serán Rina Mogaki y Akio Arisaka los estudiantes de posgrado de mi grupo.
Para comenzar a preparar el pegamento molecular de la jaula ligada punto cuántico mediante la síntesis de pegamento molecular enjaulado vinculado dibenzocyclooctyne como se describe con más detalle en otros lugares. Preparar una solución de 10 mililitros de la dibenzocicloctyne ligada al pegamento molecular enjaulado en DMSO seco. A continuación, prepare el pegamento molecular enjaulado vinculado al punto cuántico haciendo primero puntos cuánticos funcionalizados aseye.
Para lograr esto agregue 100 microlitros de 125 micromolar aseyes peg4 NHS éster en DMF a 400 microlitros de una solución DMF que contiene 500 nanomolares de puntos cuánticos que están recubiertos con clavija funcionalizada de amina. Revuelva la mezcla durante una hora a temperatura ambiente. Coloque la solución resultante en una membrana de celulosa regenerada y dialelice durante 24 horas contra 800 ml de DMF.
A continuación, diluya la solución de stock de dibenzocicloctino ligado al pegamento molecular enjaulado a 50 micromolares con DMF y añada 200 microlitros de la misma a la solución post diálisis. Revuelva la mezcla durante tres horas a temperatura ambiente. A continuación, dializar la mezcla resultante durante 24 horas contra 800 ml de DMF fresco utilizando una membrana de celulosa regenerada con el peso molecular cortado de 25000.
Después de 24 horas diluir la solución resultante a 200 nanomolares con DMF. Mantener el carcinoma hepatocelular humano HEP3 células B en el medio esencial mínimo de Eagle que contiene 10%FBS en condiciones de cultivo estándar. Un día antes del experimento sembraron 5000 células HEP3 B en 200 microlitros de medio de cultivo en cada pozo de un portaobjetos de vidrio de 8 cámaras.
A continuación, cubra el portaobjetos y colóquelo en una incubadora durante 24 horas. Al día siguiente retire el medio de cultivo y enjuague las células dos veces con 100 microlitros de PBS precalentó. A cada pozo de las 8 correderas con cámara añadir 200 microlitros de medio libre de FBS que contiene 10 micromolares de un pegamento molecular enjaulado teñido fluorescentemente.
Después de la incubación durante 3 horas retire el medio de cultivo y enjuague la muestra de células dos veces con 100 microlitros de PBS. Para visualizar los endosomas añadir 200 microlitros de medios de cultivo que contienen 100 nanomolares de un tinte fluorescente rojo adicional como LysoTracker Rojo. Incubar la muestra de célula resultante durante 20 minutos.
A continuación, retire el medio de cultivo y enjuague la muestra de células dos veces con 100 microlitros de PBS. Después devolver las células a 200 microlitros del medio de cultivo. Para inducir la translocación nuclear del pegamento molecular enjaulado teñido fluorescentemente coloque las células bajo una fuente de luz de xenón de 100 vatios equipada con un filtro de paso de banda de 365 nanómetros.
Exponga las células a la luz UV durante 2 minutos. Durante este tiempo, mantenga la muestra de célula de control sin exposición UV en la oscuridad. La tapa de los sustratos de vidrio se puede quitar para una exposición UV eficiente, sin embargo, tenga cuidado, ya que la exposición prolongada a la luz UV puede causar la muerte celular.
Para visualizar los núcleos añadir un microlitro de mancha Hoeschst al medio de cultivo. Incubar la muestra de célula resultante durante 10 minutos. A continuación, coloque la muestra en el escenario de un microscopio de escaneo láser confocal.
Grabe los micrografías para el pegamento molecular enjaulado teñido fluorescentemente, el LysoTracker Red, y la mancha nuclear. Como se ha demostrado anteriormente, la semilla 5000 células B de carcinoma hepatocelular humano HEP3 se introducen en cada pozo de un tobogán de cámara de 8 pozos y cultivo en condiciones estándar durante 24 horas. Suministre las muestras celulares con 200 microlitros del medio de cultivo libre FBS que contienen el pegamento molecular enjaulado teñido fluorescentemente.
Incubar la muestra de célula resultante durante 3 horas. A continuación, retire el medio de cultivo y enjuague la muestra de células dos veces con 100 microlitros de PBS. Devolver las células a 200 microlitros de medio de cultivo.
A continuación, sujeto a la microscopía de escaneo láser confocal de muestra y registre los micrografías como se describe en el protocolo de texto adjunto. Como se ha mostrado anteriormente sembra 5000 células B de carcinoma hepatocelular humano HEP3 en cada pozo de un tobogán de cámara de 8 pozos y cultivo en condiciones estándar durante 24 horas. Suministre las muestras celulares con 200 microlitros de medio de cultivo libre FBS que contienen 10 nanomolares del pegamento molecular enjaulado ligado a puntos cuánticos.
Incubar la muestra de célula resultante durante 3 horas. A continuación, retire el medio y enjuague la muestra de celda dos veces con 100 microlitros de PBS. Después de enjuagar las células devolverlas a 200 microlitros de medio de cultivo.
A continuación, coloque la placa debajo de una fuente de luz de xenón de 100 vatios equipada con un filtro de paso de banda de 365 nanómetros. Exponga la muestra de celda a la luz UV durante 2 minutos manteniendo las muestras de control en la oscuridad. Para visualizar los núcleos añadir 1 microlitro de mancha Hoechst al medio de cultivo.
Incubar la muestra de célula resultante durante 10 minutos. A continuación, imagine las células con un microscopio de escaneo láser confocal. Semilla del carcinoma hepatocelular humano HEP3 células B el día antes del experimento a 5000 células por pozo en una placa de cultivo de 96 pozos.
Luego cubra las células con 200 microlitros de medios de cultivo y luego coloque la placa en una incubadora durante 24 horas. Al día siguiente retire el medio de cultivo y enjuague la muestra de células dos veces con 100 microlitros de PBS. A continuación, añada 200 microlitros del medio de cultivo libre FBS que contengan el pegamento molecular enjaulado teñido fluorescentemente a concentraciones que van de 0,1 a 100 micromolares.
Incubar la placa durante 3 horas y luego colocar una placa debajo de la fuente de luz UV. Exponga la muestra de celda a la luz UV durante 2 minutos manteniendo las muestras de control en la oscuridad. Después de la exposición a los rayos UV a 10 microlitros del kit de recuento celular-8 reactivo al medio de cultivo e incubar la muestra de célula resultante durante 2 horas.
A continuación, lea la absorción de las muestras a 450 nanómetros utilizando un lector de microplacas. Antes de la radiación fotográfica HEP3 B-células incubadas con pegamento molecular enjaulado teñido fluorescente exhibe emisión de fluorescencia punctata desde el interior, un micrografo análogo que muestra el LysoTracker Red indica que el pegamento molecular enjaulado teñido fluorescente fue localizado en los endosomas. En consecuencia, la emisión de fluorescencia asignable al pegamento molecular enjaulado teñido fluorescente se observó fuera del núcleo celular antes de la radiación UV.
Después de la radiación UV, el fluorescente sugiere que el pegamento molecular enjaulado coloreado fluorescente fue sin acolar y migró al citoplasma y al núcleo celular. Tal traducción nuclear del pegamento molecular enjaulado coloreado fluorescente puede ser inducida sitio selectivamente por 2-foton cerca de la luz infrarroja. El pegamento molecular enjaulado teñido fluorescentemente en áreas no irradiadas no escapó de los endosomas y permaneció como fluorescencia punctata.
Las etiquetas de pegamento molecular enjauladas dendríticas también pueden entregar invitados macromoleculares como puntos cuánticos en el núcleo celular. Estos conjugados se pueden tomar en las células y después de la exposición UV durante 2 minutos la emisión de fluorescencia de los puntos cuánticos se puede ver dentro del núcleo. Después de este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la terapia génica exploraran el tratamiento con efectos secundarios bajos.
