La microscopía TIRF del disco giratorio puede ser una herramienta útil para estudiar el papel de la proteína durante la formación de la red citoesquelética. Esta técnica permitió la imagen tridimensional de enfoques celulares rápidos que se producen en la célula y al mismo tiempo la localización precisa de la molécula de fluorescencia que se colocan en la membrana plasmática. Este método puede proporcionar información a áreas de investigación como la microbiología, la biología celular y todas aquellas ramas donde es importante estudiar la interacción entre la membrana plasmática y el entorno celular.
Este método se puede extender a aquellos experimentos de imágenes en vivo donde es importante localizar las estructuras en la membrana plasmática y donde también desea mantener una alta resolución del volumen celular restante. Las cosas cruciales que uno tiene que considerar son la elección de la línea celular adecuada para configurar la iluminación TIRF y los otros parámetros de imagen y para encontrar el foco de las células trans infectadas. La demostración visual de este protocolo sin duda ayudaría a evitar problemas con el manejo de las celdas durante la adquisición de imágenes.
Dos días antes del experimento, siembra 3.000 células HELA o NIH 3T3 en dos mililitros de medio de crecimiento completo en cada pozo de una placa de cultivo celular de seis pozos. Al día siguiente, prepare los reactivos de transfección. En primer lugar, diluir un microgramo de RFP Livact y un microgramo de YFP Vinculin en un total de 200 microlitros de medio sérico reducido.
Vórtice el reactivo de transfección brevemente. A continuación, agregue cuatro microlitros de la mezcla a 200 microlitros de ADN. Vórtice los reactivos de nuevo y luego incubar la mezcla de transfección durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente.
Después de la incubación, agregue toda la mezcla de transfección directamente a las células. Mezcle los pozos agitando la placa y luego colóquela de nuevo en la incubadora. El día del experimento, prepare la muestra para imágenes en vivo recubriendo primero un plato inferior de vidrio de 35 milímetros con una solución de 10 microgramos por mililitro de Fibronectin en PBS.
Dejar la solución sobre la superficie de vidrio durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego retirarla y dejar que el plato se seque al aire. A continuación, diluir una solución de perlas multi fluorescentes de 0,1 micras de diámetro a una densidad de 1.800 millones de partículas por mililitro en agua destilada. Agregue la solución a la superficie de vidrio recubierto de Fibronectina durante 30 a 60 segundos.
A continuación, retire la solución y deje que el plato se seque al aire. El recubrimiento previo de los platos con perlas fluorescentes sólo es necesario por dos razones, primero si desea encontrar el plano TIRF antes de sembrar las celdas o adquirir una imagen de cuenta de dos colores para el registro de la imagen. Ahora preparar un medio de crecimiento antioxidante mediante la adición de 0,1 solución de ácido ascórbico molar a una concentración final de 0,1 milimolar en medio de crecimiento.
Precalienta los medios colocándolos en un baño de agua celsius de 37 grados. A continuación, lavar las células con dos mililitros de PBS y añadir 250 microlitros de Trypsin EDTA a cada pozo de la placa. Incubar las células a 37 grados centígrados y esperar de dos a tres minutos hasta que las células estén completamente desprendidas.
Resuspender cuidadosamente las células en un mililitro de medio de crecimiento antioxidante precalentado y añadirlas a cuatro mililitros adicionales del medio en un tubo de cultivo celular de 15 mililitros. Coloque la suspensión celular con una tapa ligeramente abierta en una incubadora de 37 grados Centígrados amortiguado con un 5% de dióxido de carbono. Para empezar, iniciar el control ambiental del microscopio para lograr condiciones estables de cultivo celular.
A continuación, coloque el plato de fondo de vidrio que contiene un mililitro de medio de crecimiento antioxidante precalentado en el soporte de muestra del microscopio precalentado. A continuación, en el software de imágenes, configure los ajustes de adquisición en el microscopio. Establezca el intervalo de tiempo de adquisición en 30 segundos y la duración entre 60 y 90 minutos.
Además, active la función de enfoque automático del enfoque automático basado en hardware para cada punto de tiempo estableciendo el valor en uno. Ahora ajuste la exposición de la cámara a 200 milisegundos, el nivel de ganancia a 500 y la potencia del láser al 20% para cada canal. Se recomiendan altos niveles de ganancia, bajo tiempo de exposición y baja potencia láser para reducir la fototoxicidad.
A continuación, establezca la pila Z para los canales de disco giratorio en 10 micras con un espaciado de 0,4 micras y, a continuación, establezca el desplazamiento inferior en cero para que el plano más bajo sea la posición de enfoque del enfoque automático de hardware y desactive las pilas Z para los canales TIRF. Por último, active las posiciones de la etapa de función multipunto. Esto permitirá que se registren hasta tres posiciones en un intervalo de 30 segundos.
Ahora encuentra las perlas fluorescentes con iluminación epifluorescente, activa un canal TIRF y establece el ángulo de iluminación en un valor que denota iluminación TIRF. A continuación, active el enfoque automático pulsando el botón en el panel del microscopio y ajuste el enfoque con la rueda de desplazamiento. Una vez en el foco, adquiera un conjunto de datos de dos colores utilizando TIRF 488 y TIRF 561 para el posterior registro de imágenes basado en cuentas.
Retire las células de la incubadora y mezcle la suspensión celular invirtiendo el tubo cerrado de dos a tres veces. Luego aplique un mililitro de las células en la antena para tomar imágenes. Encuentre rápidamente células trans infectadas dobles con iluminación epifluorescente de bajo nivel.
Una vez encontradas, centra las celdas en la vista previa de la cámara en vivo usando la iluminación de campo brillante y marca la posición. A continuación, busque uno o dos puntos de interés adicionales, guárdelos en la lista de posiciones y comience la adquisición de datos haciendo clic en el botón de secuencia. Al principio, las células se pueden separar fácilmente debido al movimiento de la etapa, por lo que es mejor establecer de cuatro a cinco posiciones y más tarde descartar una o dos.
Con el fin de generar una hiperpila libre de registro en Fiji, primero descargue y guarde el archivo SD-TIRF_helper_jove proporcionado. ijm en las macros de la subcarpeta Fiji. Ejecute la macro haciendo clic en el comando de menú comenzando con plugins y luego macros y finalmente ejecutar.
Si los canales de color necesitan corrección de registro, seleccione la opción y cree una nueva referencia de registro basada en cuentas conocida como archivo de referencia. A continuación, importe los datos con el importador de bioformatos y elija hyperstack como opción de visualización. Cargue el conjunto de datos de imagen, seleccione la serie de discos giratorios en el primer paso y la serie TIRF en el segundo paso.
En este punto, Fiji mostrará los datos ordenados por canal y posición de etapa. Aplique la corrección de registro a los canales respectivos cargando el archivo de referencia predeterminado. A continuación, seleccione la tabla de búsqueda de color deseada para cada disco giratorio y canal TIRF y combínelos en una sola hiperapilación multidimensional.
Durante el procesamiento de las imágenes TIRF, se añade un número de planos zed al plano inferior y este número coincide con el número de planos de los conjuntos de datos de disco giratorio. Eso es muy importante para la representación visual de la hiperpilar final. Usando la configuración descrita en este video, se seleccionaron las células de expresión de YFP y RFP y su proceso de adhesión se observó durante un timelapse de 60 minutos.
Como era de esperar, las células tenían forma redonda y sólo eran débilmente adherentes al principio con protuberancias de membrana que detectaban el medio ambiente y hacían contacto con el sustrato. El contacto de la matriz celular se fortaleció rápidamente tras la formación de las llamadas adhesiones nacientes. Con el paso del tiempo, los complejos de adhesión se agrandan y maduran a adherencias focales.
Estas estructuras alargadas eran predominantemente evidentes en la periferia de la célula. Esto fue el resultado de las fuerzas que fueron ejercidas por las fibras de actomiosina que indujeron el fortalecimiento de las adherencias de la matriz celular, así como la agrupación de fibras de actina. La célula también se aplanó como resultado de la formación de la red actin.
La velocidad de adquisición depende de los siguientes parámetros, el intervalo de tiempo, el tiempo de exposición, el número de planos zed y el número de posiciones. Por lo tanto, es muy importante optimizar estos parámetros para altas tasas de adquisición. La implementación de la nueva tecnología de disco giratorio convertirá la microscopía TIRF de disco giratorio en una nueva técnica de microscopía de super resolución que permitirá la toma de imágenes a altas velocidades temporales.
La microscopía de disco giratorio es una técnica muy poderosa para estudiar los procesos que se producen entre el interior de la célula y la membrana celular. Se ha demostrado que podemos seguir la dinámica de la vesícula adquiriendo pilas de imágenes muy grandes en pocos segundos. La luz láser colisionada es peligrosa para los ojos.
Nunca mire directamente a la viga y utilice las precauciones de seguridad del instrumento para evitar la exposición directa a la luz.
