Este protocolo ayuda a establecer la conexión entre la fuerza molecular y el comportamiento de rodadura celular, además de permitir mapear espacialmente y cuantificar la adhesión de rodadura a nivel molecular. Esta técnica permite estudiar eventos de adhesión individuales durante el rodadura celular real, lo que nos permite medir directamente la fuerza de adhesión molecular fisiológica relevante. La preparación de la superficie utilizando la concentración adecuada y el tiempo de incubación en cada paso es crucial para lograr una funcionalización de la superficie de alta calidad.
La calidad de las bioconjugaciones y las condiciones adecuadas también son cruciales. La demostración visual es fundamental para ayudar a los investigadores a replicar este protocolo. En particular, los pasos como el ensamblaje de la cámara de flujo y el postprocesamiento de imágenes se beneficiarán enormemente de una demostración visual.
Comience extendiendo finamente una pequeña cantidad de epoxi en ambos lados de la cinta de doble cara con una cuchilla de afeitar. Usando un láser, corte la cinta recubierta de epoxi para crear cuatro canales. Cree el chip de flujo intercalando la cinta epoxi entre una diapositiva de cuatro orificios y una cubierta PEG.
Usando una punta de pipeta, aplique una presión suave a lo largo de los canales para crear un buen sello, luego cure el epoxi durante un mínimo de una hora. Alinee el chip de modo que la apertura de cada canal se coloque en los centros del adaptador. Luego coloque dos espaciadores acrílicos transparentes en la parte superior del chip.
Aplique una presión firme en el centro del bloque y atornille en los extremos de cada espaciador. Atornille las entradas en los orificios roscados del otro lado del soporte y controle la condición de sellado a través del bloque de acrílico transparente. Fluya 200 microlitros de tampón de lavado en la cámara para verificar si hay fugas.
Si se forman burbujas en el canal, empuje agresivamente 200 microlitros adicionales de tampón de lavado para eliminar las burbujas. Agregue 40 microlitros de BSA a la cámara de flujo para evitar la unión inespecífica e incube durante 10 minutos en la cámara de humedad. Después de la incubación, agregue 40 microlitros a Tween 20 a la cámara de flujo y vuelva a incubar durante 10 minutos para reducir aún más la unión inespecífica.
Luego lave el canal con 200 microlitros de tampón de lavado para eliminar todos los agentes de pasivación. Para la funcionalización de la superficie de la cámara, agregue 40 microlitros de streptavidin a la cámara de flujo e incube durante 20 minutos, luego lave la cámara con 200 microlitros de tampón de lavado. Ahora, agregue 40 microlitros de proteína hibridada G-TGT a la cámara de flujo e incube durante 20 minutos.
Después de lavar con el tampón de lavado, agregue 40 microlitros de la hebra superior de proteína G-TGT e incube durante 20 minutos para completar cualquier hebra inferior de TGT no hibridada en la superficie y luego lave con tampón de lavado. Finalmente, agregue 40 microlitros de P-selectin-Fc a la cámara de flujo e incube durante 60 minutos antes de lavar con tampón de lavado. Llene una jeringa de vidrio de cinco mililitros con el amortiguador rodante y golpee los lados de la jeringa para desalojar y empujar las burbujas hacia afuera a medida que flotan hacia la punta.
Después de insertar una aguja estéril en una pieza de 200 milímetros de tubo de polietileno, conecte la aguja a la jeringa de vidrio. Fije la jeringa en la bomba de la jeringa e incline la bomba de la jeringa de tal manera que el lado del émbolo esté elevado para evitar que las burbujas de aire entren en el canal. Inserte el extremo del tubo en la entrada de la cámara de flujo.
Inserte un extremo de otra pieza de 200 milímetros del tubo de polietileno en la salida y sumerja el otro extremo en un vaso de precipitados de desecho. Tome de uno a dos mililitros de la muestra de suspensión celular y centrífuga para granular las células. Retire el medio y vuelva a suspender suavemente las células en 500 microlitros del tampón rodante.
Desconecte cuidadosamente el tubo de las entradas y la salida y pipetee 40 microlitros de la suspensión celular en la cámara de flujo. Vuelva a conectar el tubo como se describió anteriormente, asegurándose de que no se introduzcan burbujas en el canal de flujo. Comience el experimento de rodadura de celdas iniciando la bomba de jeringa a los caudales deseados.
Observe el balanceo celular usando un microscopio de campo oscuro con un objetivo 10X. Una vez que se complete el experimento, retire las células del canal infundiendo el búfer rodante a 100 mililitros por hora hasta que la superficie esté libre de células. Para obtener imágenes de las pistas locales mediante DNA-PAINT, agregue 40 microlitros de hebra de generador de imágenes DNA-PAINT preparada en tampón DNA-PAINT al canal.
Realizar microscopía de fluorescencia de reflexión interna total utilizando las condiciones mencionadas en el texto manuscrito. Localice y renderice las imágenes de superresolución. Para obtener imágenes de las pistas largas mediante etiquetado permanente, agregue la hebra de generador de imágenes permanente e incube durante 120 segundos en el búfer T50M5.
Luego lave el canal infundiendo 200 microlitros de tampón de lavado. Grabe una imagen con el láser de excitación desactivado para obtener el ruido de fondo de la cámara. Imagen de un área grande en un patrón de cuadrícula mediante microscopía TIRF.
Programe el microscopio para escanear sobre el área de 400 por 50 imágenes y divida los datos sin procesar en archivos TIP individuales, cada uno con un máximo de 10, 000 imágenes utilizando el programa ImageJ. Aplana todas las imágenes usando el perfil de iluminación y usa el plugin MIST para unir las imágenes. El resultado para la caracterización de la bioconjugación de la proteína G ssDNA mostró una proporción de casi uno es a uno de la proteína G a ssDNA donde la proteína G Maleimida ssDNA y los espectros tampón de elución de imidazol de la base ortogonal para ajustarse al espectro de productos de bioconjugación.
Se utilizó PAGE nativo para confirmar la bioconjugación que muestra las bandas de color verde brillante que coinciden con la banda G de la proteína monomérica que indica una conjugación exitosa y un buen rendimiento. El perfil de iluminación TIRF introducido a partir de una fibra monomodo es generalmente más brillante en el centro del campo de visión y más tenue alrededor de los bordes. Para compensar la iluminación desigual y aplanar las imágenes para el análisis cuantitativo, el perfil de iluminación se determinó promediando miles de fotogramas individuales.
Las imágenes aplanadas se produjeron restando el ruido de la cámara de los perfiles raw y de iluminación y luego normalizándose por el perfil de iluminación. Las costuras en bruto mostraron patrones periódicos claros correspondientes a las imágenes no corregidas, mientras que el mismo campo de visión cosido a partir de imágenes aplanadas produjo un fondo plano. Se utilizó un perfil de flujo de rampa hacia arriba para determinar el rango de tensión de cizallamiento que resultó en el laminado celular y el rendimiento de pistas de fluorescencia bajo las cuales se podía ver una huella de adhesión típica de una sola célula.
Se muestran resultados subóptimos y óptimos de pistas fluorescentes con contraste insuficiente, densidad de pista excesiva, densidad y contraste óptimos de la pista, y imágenes de difracción limitada y DNA-PAINT. El tiempo de incubación superior a 60 minutos asegura la funcionalización de la superficie y la construcción adecuada de la cámara evita el paso de burbujas que dañan la superficie funcionalizada. Este procedimiento es aplicable para el análisis cuantitativo de la fuerza molecular involucrada en la adhesión a la rodadura y permite a los investigadores comprender el comportamiento de rodadura de los diferentes tipos de células.
Esta técnica permite a los investigadores explorar nuevas preguntas sobre los eventos de adhesión rápida que conducen a un mayor avance de la investigación de moléculas individuales y mecanobiología.
