La migración colectiva de células a menudo se guía por el gradiente de moléculas de señalización. En este video, demostramos cómo cuantificar las fuerzas celulares durante la migración colectiva guiada por gradiente bioquímico. Por lo tanto, integramos el chip microfluídico con microscopía de tracción, luego usamos el chip microfluídico para generar gradiente bioquímico, y usamos la microscopía de tracción para medir la fuerza celular.
Hwanseok Jang, un postgrado en mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Prepare la solución PDMS mezclando el elastómero base y el agente de curado en una proporción de diez a uno. Coloque 15 mililitros del elastómero base en un tubo cónico de 50 mililitros y agregue 1,5 mililitros de agente de curado.
Prepare dos de estos tubos. Vórtice la mezcla PDMS durante cinco minutos antes de centrifugar a 196 g de tiempo durante un minuto para eliminar las burbujas. Para fabricar la galería de símbolos PDMS, vierta aproximadamente un mililitro de la mezcla PDMS en la oblea evitando las regiones con patrones SU-8 para que pdmS toque el lado de los pilares SU-8, pero no la parte superior del patrón SU-8.
Coloque la oblea sobre una superficie plana durante más de 30 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, cure los PDMS en un horno seco a 80 grados centígrados durante más de dos horas. Despegar cuidadosamente el PDMS del molde SU-8, recortar la membrana delgada PDMS utilizando un punzón hueco de 14 milímetros. Retire el polvo de la superficie de las piezas de PDMS con cinta adhesiva antes de autoclave las plantillas PDMS.
Para fabricar microcanal PDMS, vierta aproximadamente 30 mililitros de mezcla PDMS sobre el molde SU-8. Desgas durante 30 minutos en una cámara de vacío, y luego curar el PDMS en un horno seco a 80 grados Celsius durante más de dos horas. Despegue cuidadosamente los PDMS del molde SU-8 y corte el PDMS a un tamaño de 24 milímetros por 24 milímetros.
En cada bloque PDMS, cree una salida y tres entradas con un punzón de biopsia de un milímetro. Fabricar y silanizar diapositivas de vidrio como se describe en el protocolo de texto. Cubra la superficie bordeada del vidrio inferior con 100 microlitros de la solución de encuadernado-siano.
Después de dejar el vaso a temperatura ambiente durante una hora, enjuague el vaso tres veces con agua desionizada. A continuación, deje que el vidrio se seque a temperatura ambiente del aire o soplando aire comprimido. Prepare la solución de gel de poliacrilamida como se describe en el protocolo de texto.
A continuación, transfiera para 10 microlitros de solución de gel mezclado en el micropocio rectangular y coloque un resbalón de cubierta circular en la parte superior. Fije el montaje de vidrio personalizado, solución de gel y tapón de cubierta en la cubierta de una placa de seis pozos con cinta adhesiva y voltéelo. A continuación, centrifugar durante 10 minutos a 96 veces g para llevar partículas fluorescentes a la capa superior del gel de poliacrilamida.
Retire el conjunto de la centrífuga y colóquelo sobre una superficie plana con el resbalón de la cubierta hacia abajo. Después de 30 minutos, voltee el conjunto y colóquelo en una placa Petri de 35 milímetros. Llene el plato con dos mililitros de agua desionizada.
Con fórceps, retire suavemente el resbalón de la cubierta deslizándolo hacia un lado. Para codificar el colágeno en el gel de poliacrilamida, disuelva un miligramo por mililitro sulfo-SANPAH en un tampón HEPES cálido de 50 mililitros. Suelte 200 microlitros de la solución sobre la superficie del gel y actívelos con luz UV durante 10 minutos.
Después de la activación UV, enjuague el gel dos veces con 0.1 molar HEPES tampón, y luego una vez con PBS. Codifle el gel de poliacrilamida con solución de colágeno a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, lave el gel tres veces con PBS.
Sumerja la plantilla PDMS autoclaved en la solución F-127. Guárdalo en una incubadora de 37 grados Celsius durante una hora. Lave la plantilla PDMS con PBS tres veces y retire el líquido tanto de la plantilla PDMS como del gel de poliacrilamida.
A continuación, coloque la plantilla PDMS en el gel de poliacrilamida y agregue PBS a la plantilla. Elimine las burbujas en los orificios de la plantilla PDMS pipeteando suavemente. Después de eliminar burbujas, borre el PBS de la superficie de la galería de símbolos PDMS.
Ahora agregue 200 microlitros de la solución celular en la plantilla PDMS y coloque el gel en una incubadora durante una hora para que las células se adhieran al gel de poliacrilamida. Después de la incubación, lave suavemente la solución celular con medios de cultivo celular y agregue más medios de cultivo celular. Retire la plantilla PDMS, compruebe la formación de islas celulares bajo un microscopio.
A continuación, trate la superficie del microcanal PDMS con plasma de oxígeno durante 30 segundos. Después de extraer cualquier líquido en el vidrio inferior lleno de gel de poliacrilamida, coloque el microcanal PDMS en la parte superior del vidrio inferior y coloque el conjunto en el soporte de vidrio personalizado. Llene el microcanal con un medio de cultivo celular.
Para preparar el tubo de entrada del sistema microfluídico integrado, conecte una aguja recortada y una línea de mini volumen de 30 centímetros con un llavero de tres vías. Prepare tres de estos arreglos. Para el tubo de salida, conecte una aguja recortada y una línea de mini volumen de 75 centímetros con un llavero de tres vías.
Llene las líneas de tubo con el medio que se ha precalentado durante una hora. Prepare los depósitos retirando los émbolos de las jeringas y conectando las tuberías de entrada. Enchufe los conectores de aguja de cada línea de tubería en las tres entradas y una salida del dispositivo microfluídico.
Llene cada depósito con tres mililitros de medio fresco o medio acondicionado. Para la prueba de gradiente, llene el depósito de entrada izquierdo con 20 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de hepatocitos, o HGF, en el medio de cultivo celular. Para la visualización del gradiente de concentración, agregue 200 microgramos por mililitro de tinte fluorescente al depósito de entrada izquierdo.
Conecte la línea de tubo de salida a una bomba de jeringa. Coloque el sistema microfluídico integrado en el escenario de un microscopio epifluorescente convencional. Tome imágenes cada 10 minutos durante un máximo de 24 horas utilizando un microscopio automatizado alojado en una incubadora.
En cada punto de tiempo, tome un conjunto de imágenes usando una lente objetivo 4X en tres canales diferentes, incluyendo una imagen de fase para visualizar la migración celular, una imagen fluorescente verde para visualizar cuentas fluorescentes incrustadas en el gel, y una imagen fluorescente roja para visualizar el gradiente de concentración de un producto químico. Después de tomar imágenes de lapso de tiempo, infunda una solución de 0,25% de Trypsin-EDTA en microcanales para separar las células del gel de poliacrilamida. Al eliminar completamente las células del gel, tome una imagen fluorescente verde para ser utilizada como imagen de referencia para la microscopía de tracción.
Continúe con el análisis de datos como se describe en el protocolo de texto. Para medir la fuerza contráctil y la tensión intercelular, la microscopía de tracción y la microscopía de tensión monocapa se combinaron con el canal microfluídico. Los mapas fueron trazados en coordinación radioeléctrico con tracción exterior usando color cálido y tracción interior usando color frío.
En el momento cero, todas las islas mostraron distribuciones de tracción similares con una fuerte tracción hacia adentro en el borde y fluctuación dentro de la isla. Después de 10 horas de aplicar el gradiente HGF, mientras que el grado de expansión de la isla fue diferente en cada columna, las distribuciones de tracción fueron en gran medida similares al tiempo cero. La tracción media no cambió durante 10 horas.
Sin embargo, al calcular la tensión monocapa, cada columna mostraba tendencias diferentes. Cuando la concentración de HGF fue baja, la tensión media dentro de las islas se mantuvo alrededor de 200 pascales durante un período de 10 horas. Cuando la concentración de HGF fue alta, la tensión media dentro de las islas disminuyó gradualmente de 230 pascales a 100 pascales durante 10 horas, como se mostró anteriormente.
Cuando la concentración de HGF era alta en la mitad izquierda y baja en la mitad derecha de la isla, la tensión promedio se mantuvo alrededor de 150 pascales. Llenar el canal microfluídico debe ser suave. Es importante eliminar las burbujas atrapadas en el canal mientras que al mismo tiempo no interrumpir las islas celulares micro padres.
Mediante el uso de este sistema integrado, se puede investigar cómo el colectivo celular responde mecánicamente a varios gradientes químicos, como los atractores de quimio o factores de crecimiento. Esta plataforma nos ayudará a explorar más a fondo la mecánica de la migración colectiva de células bajo gradientes químicos, que es la clave para entender la regeneración, la metástasis del cáncer y el desarrollo.
