Una ventaja de este protocolo es que la hoja de gusanos es fácil de manejar. La hoja tiene características que evitan el secado, lo que nos permite llevar a cabo la irradiación de microbo remos a los animales vivos, realizar varios ensayos conductuales y la observación a largo plazo. Los canales microfluídicos en esta hoja de gusanos están abiertos, por lo que es más fácil recoger animales.
Estas hojas de gusano también se pueden utilizar repetidamente, haciéndolos más económicos. Cuando estábamos desarrollando esta técnica, queríamos irradiar sólo una parte de los animales con un micro hacedo bajo un microscopio. Así que necesitábamos fichas claras, muy delgadas capaces de sostener a los animales.
Para empezar, coloque una hoja delgada y transparente en el escenario para usarla como película de cubierta inferior. Coloque suavemente una hoja de gusano en la película de la cubierta inferior con pinzas planas. Coloque al menos tres gotas de solución tampón en la superficie de una placa Petri de 6 centímetros sin tratar.
Luego, escoge varios C.elegans adultos con un recolector de platina de un plato de cultivo. Transfiera a los animales a una gota con el recolector de platina y permita que los animales naden en tampón para eliminar cualquier bacteria. Lavar a los animales en dos gotas separadas y enjuagar los animales en otra gota.
A continuación, coloque una gota de solución de búfer en la superficie de la hoja de gusano. Retire los animales lavados de la gota de tampón y transfiéralos a una gota en la hoja de gusano. Utilice pinzas planas para colocar una película de cubierta PS sobre la hoja de gusanos y presione suavemente sobre los canales de un extremo de la hoja al otro.
O simplemente deje caer los animales en gotas y selle suavemente con la película de la cubierta para que las gotas se esparcen entre la cubierta y las hojas de gusanos con los animales dentro del canal. Confirme que los animales están vivos comprobando si hay movimiento con un microscopio con aumento de 1-2x. Registre las posiciones de los animales y observe específicamente el número del canal en el que está encerrado cada animal, y la posición de cada animal en el canal.
Para recoger animales inmovilizadores, utilice pinzas planas para retirar la película de cubierta de la hoja de gusano y, a continuación, deje caer entre 10 y 15 microlitros de solución tampón en uno de los canales microfluídicos que encierran a los animales. Bajo el estereomicroscopio, observa a los animales a medida que empiezan a girar. A continuación, utilice el recolector de platina para recoger a los animales de natación y transferirlos a una placa de ensayo.
Después de encerrar a los animales como se ha demostrado anteriormente, observe manchas fluorescentes en los animales con un microscopio de harina. A continuación, imagine la propagación de ondas de iones de calcio utilizando la adquisición de vídeo para observar actividades dinámicas. Coloque la hoja de gusano usada en un petri-dish de seis centímetros y coloque alrededor de 100 microlitros de agua ultrapura esterilizada en la hoja.
Use los dedos engulatados para esparcir agua en la superficie de la sábana y lavar cualquier contaminante. A continuación, utilice toallitas desechables para eliminar la humedad de la hoja de gusano. Dispensar cinco mililitros de 70% de etanol en el Petri-dish y usar dedos engulo para esparcir el etanol sobre la hoja de gusano.
Finalmente, después de que la hoja esté seca, coloque la hoja en un Petri-dish estéril y cubra. Usando este protocolo, se investigó la idoneidad de diferentes películas de portada. No hubo diferencia significativa en la motilidad entre los animales de control y los animales encerrados en canales microfluídicos con película PS.
Por el contrario, la motilidad se redujo significativamente en animales encerrados bajo un vaso de cubierta. La motilidad de los animales encerrados con una película para mascotas también disminuyó significativamente. Es importante seleccionar cuidadosamente las películas de cubierta para el sellado de canales microfluídicos.
Usando este protocolo, evaluamos la idoneidad de diferentes películas de cubierta a través de ensayos de locomoción de los animales tres horas después de la inmovilización en el chip. Usando esta técnica, teníamos la intención de desarrollar un chip humectable ultrafino sólo para la irradiación de microbios. Sin embargo, estas hojas de gusanos ya se han utilizado para ensayos de imágenes y comportamiento más allá de sus aplicaciones originales.
