Agradecemos al Dr. Ray Krishanu para las poblaciones de Drosophila, Tarjani Agarwal para el mantenimiento de una jaula de Drosophila, Peter Juo para nuIs25 CGC y de C. elegans cepas. SPK jsIs609 hecho en el laboratorio de Nonet de Michael. Damos las gracias a Arpan Agnihotri (BITS Pilani) por su ayuda en time-lapse de transporte mitocondrias de los animales jsIs609 en dispositivos de microfluidos. Estamos muy agradecidos con el Dr. Vatsala Thirumalai Surya Prakash y por darnos embriones de pez cebra. Damos las gracias a la Dra. Krishna y CIFF en BCN para uso del microscopio confocal de disco giratorio apoyado por el Departamento de Ciencia y Tecnología-Centro para la Nanotecnología (N º SR/55/NM-36-2005). También damos las gracias Kaustubh Rau, V. y Venkatraman Sachidanand Chetana para los debates. Este trabajo fue financiado por el DBT beca posdoctoral (SM), DST vía rápida esquema (SM) y una subvención a DBT (SPK). SA fue apoyado por becas de horario de verano y el CSIR a SPK.

1. SU8 Maestro de Fabricación <ol><li> Diseño de las estructuras de microfluidos con software Clewin e imprimirlo utilizando 65.024 plotter láser DPI con dimensión mínima de 8 m en la película placa de circuito. </li><li> Limpiar 2 cm X 2 cm obleas de silicio con óxido nativo en KOH al 20% durante 1 min y enjuague con agua desionizada; cada una oblea para la capa de flujo y su capa de control correspondiente. </li><li> Secar las piezas con gas nitrógeno y se deshidratan en una placa caliente a 120 ° C durante 4 horas. Permitir que las piezas se enfríen a temperatura ambiente antes de proceder a la siguiente etapa. </li><li> Colocar las piezas de silicio de una en una en el plato giratorio y girar en el vacío. Cubrir las superficies de silicio con ~ 20 l hexametil-disilazano (HMDS) y recubrirlos con una. SPIN150 spinner a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 3.000 rpm durante 30 sec </li><li> Cubra las obleas de silicio totalmente con ~ 1,5 ml de SU8-2025 ( <a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm" target="_blank">http://</a>www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) y obleas capa utilizando SPIN150 spinner a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 2.000 rpm durante 30 sec. Este protocolo hilado produce un espesor fotorresistente de ~ 40 m que es adecuado para el control de flujo y las capas para las primeras etapas de larvas de C. elegans. </li><li> Centrifugación ~ 1,5 ml SU8-2050 usando SPIN150 spinner a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 2.000 rpm durante 30 segundos para obtener un espesor fotorresistente de ~ 80 m que es adecuado para la fabricación de flujo de la capa para fines de estadios larvales de C. elegans, capa de flujo basal para Drosophila / pez cebra larvas y sus capas de control correspondientes. </li><li> Coloque las piezas de silicio en la placa caliente con la capa SU8 revestido en la parte superior. Soft cocer las piezas de silicio recubiertas a 65 º C durante 1 min seguido por 95 º C durante 10 min. Permitir que las piezas se enfríen a temperatura ambiente antes de proceder a la siguiente etapa. </li><li> Coloque las piezas de silicona suave al horno en el escenario de exposición con SU8-2025 recubierto surcara en la parte superior frente a la lámpara UV. Utilice la máscara foto con diseño I (L1, figura 1B) y el diseño II (L2, Figura 1B) para la capa de flujo y el patrón de la capa de control, respectivamente, para los primeros estadios larvarios de C. elegans. Coloque la máscara foto en la parte superior de la capa de SU8 y asegurar la máscara es plana contra la capa de recubrimiento. Abra el obturador de la lámpara UV y exponer las suaves horneados SU8 obleas de hasta 200 vatios de la lámpara UV a través de la máscara de foto durante 15 s. </li><li> Utilice la máscara foto con diseño I (L1, figura 1B) y el diseño II (L2, Figura 1B) en SU8-2050 piezas recubiertas (preparado en el paso 1,6) para la fabricación de la capa de flujo y la capa de control para fines de estadios larvales de C. elegans. Utilice la máscara foto con el diseño I (L1, figura 1C) y el diseño II (L2, Figura 1C) para la capa basal y la capa de flujo de control, respectivamente, para Drosophila / pez cebra larvas en las obleas recubiertas con SU8-2050 (preparado in paso 1,6). Exponer las superficies de SU8 través de la máscara foto a la lámpara UV de 200 vatios durante 15 segundos. </li><li> Coloque los trozos de silicio expuesto sobre una placa caliente con la capa de revestimiento en la parte superior. Publica hornear las obleas a 65 ° C durante 1 min seguido por 95 º C durante 10 min. Permitir que las piezas se enfríen antes de proceder al siguiente paso. </li><li> Desarrollar las piezas con la solución de revelado SU8 durante 20 min. Enjuague las piezas en alcohol isopropílico (IPA) y secado de gas con nitrógeno. </li><li> Coloque los trozos de silicio en un desecador con el patrón de SU8 en la parte superior. Recubrir las piezas con 50 l de tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano vapor en un desecador durante 2 hr. </li></ol> Precauciones: Tome las precauciones de seguridad para el manejo de sustancias químicas durante el tratamiento KOH, capa fotosensible y en desarrollo. Silano revestimiento vapor debe realizarse dentro de un desecador en un área ventilada. Proteja SU8 resistir de la exposición excesiva a la luz. Utilice gafas de protección UV con una light fuente. 2. PDMS fabricación de moldes <ol><li> Preparar 10:01 PDMS mediante la combinación de 50 g de Sylgard 184 base con 5 g de agente de curado en una taza de plástico. Mezclar el contenido manualmente para ~ 3 min. Desgasificar la mezcla dentro de un desecador para eliminar todas las burbujas de aire formadas durante la mezcla. </li><li> Verter una mezcla de 5 mm de espesor PDMS sobre las obleas de silicio con SU8 patrón de diseño II, para la capa de control, con cuidado para evitar la formación de burbujas de aire. En caso de que se forman burbujas durante el vertido, desgasificar el PDMS en el patrón de SU8 en bajo vacío para eliminar todas las burbujas. </li><li> Coloque las obleas de silicio con SU8-2025 patrón de diseño que, para la capa de flujo, el plato giratorio y encienda la aspiradora para sostenerlos. Cubrir las obleas con ~ 1 ml de mezcla de PDMS y capa de las obleas utilizando SPIN150 spinner a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 1.500 rpm durante 30 sec. </li><li> Escudo ~ 1 ml PDMS mezcla en obleas de silicio con el 80 micras SU8-2050 patrón de diseño I (L1, figura 1B), para laflujo de la capa para finales de estadios larvales de C. elegans utilizando el spinner SPIN150 a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 1.000 rpm durante 30 sec. Escudo una gruesa capa de mezcla PDMS sobre las piezas de silicio con SU8-2050 modelo de flujo de diseño I capa (L1, figura 1C) para Drosophila / pez cebra, usando larvas SPIN150 spinner a 500 rpm durante 35 seg. </li><li> Hornee piezas PDMS recubiertos de silicio del diseño I y obleas con diseño correspondiente II para el control de la capa que contiene PDMS para C. elegans y / o Drosophila / pez cebra larvas en un horno de convección de aire caliente a 50 ° C durante 6 horas. </li><li> Cortar la pieza de PDMS del sustrato de silicio que contiene el patrón II SU8 de C. elegans y / o larvas de Drosophila / pez cebra con una cuchilla afilada. Un pequeño orificio de diámetro 1 ~ mm en la parte superior del depósito de conectar la trampa principal en el molde de PDMS usando un golpeador Harris. </li><li> Coloque el bloque perforado PDMS (que contiene el molde 40 m de espesor para el controlcapa L2) en una bandeja de plástico, con el lado de moldeado de la capa de control hacia arriba. Coloque la oblea de silicio recubierto de PDMS que contiene los 40 m de grosor SU8 I diseño en la misma bandeja, con la superficie recubierta hacia arriba PDMS. Introduzca la bandeja en el interior de la cámara de limpiador de plasma y encienda el vacío durante 2 min. A continuación, encienda el plasma y reducir la presión en la cámara hasta que la cámara se vuelve rosa de color claro. Exponga las dos superficies a 18 vatios aire plasma al vacío bajo durante 2 min. </li><li> Coloque el bloque perforado PDMS retirados de las 80 micras de espesor que contiene SU8 maestro II modelo para finales de estadios larvales de C. elegans o Drosophila / pez cebra larvas en una bandeja de plástico, con el lado de moldeado de la capa de control hacia arriba. Coloque el correspondiente giro al horno PDMS capa revestida en la oblea de silicio que contiene 80 micras de espesor diseño I para más tarde C. elegans etapas o Drosophila / pez cebra larvas simultáneamente en la misma bandeja con el plano s recubierto PDMSurface hacia arriba. Utilice el mismo protocolo mencionado anteriormente para exponerlos al aire plasma. </li><li> Coloque las dos superficies tratadas por plasma C. elegans y / o Drosophila / pez cebra larvas junto con una presión suave y hornear en horno de convección de aire caliente a 50 ° C durante 2 horas. </li><li> Cortar los dispositivos enlazados desde el sustrato de silicio con diseño I SU8 de C. elegans y / o larvas de Drosophila / pez cebra. Perforar orificios de acceso a los depósitos de entrada y de salida del canal de flujo. </li><li> Coloque el molde en condiciones de servidumbre PDMS en una bandeja de plástico para C. elegans, con la parte de trazado del diseño de la capa de flujo hacia arriba. Limpie el vidrio cubreobjetos (22 x 22 mm, No. 1 espesor) y colocarla en la bandeja de plástico mismo. Inserte la bandeja que contiene el molde de PDMS y antideslizante cubierta de vidrio en el interior de la cámara de plasma. Exponer la superficie inferior del dispositivo de PDMS y el deslizamiento de vidrio cubierta de 18 vatios de plasma de aire a baja presión durante 2 min. Coloque las dos superficies tratadas con plasma genpresión TLE y hornear en horno de convección de aire caliente a 50 ° C durante 2 horas. </li><li> Guarde el dispositivo en un entorno limpio para su uso futuro. </li></ol> 3. Pasos adicionales para Drosophila / Pez cebra dispositivo <ol><li> Exponer la superficie de vidrio limpio de tamaño de 2 cm X 2 cm de altura con 50 l de tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano vapor en un desecador durante 2 hr. </li><li> Centrifugación ~ 1 ml de 10:1 mezcla PDMS preparada en la etapa 2,1 en la superficie de vidrio silanizada usando SPIN150 spinner a 500 rpm durante 35 seg. Hornear los sustratos de vidrio recubiertas de PDMS en un horno de aire caliente a 50 ° C durante 6 horas con la superficie recubierta hacia arriba. Permitir que la capa de PDMS que se enfríe a temperatura ambiente antes de proceder a la siguiente etapa. </li><li> Ponche de la capa de revestimiento utilizando una costumbre golpeador construido de metal afilado en el medio de la PDMS, para formar la capa de separación PDMS. La forma de la perforadora de metal está diseñado similar al diseño de flujo para Drosophila / pez cebra (L1, figura 1C </strong&gt;). </li><li> Exponer la capa separadora PDMS y de un solo bloque de servidumbre (capa y capa de control de flujo, en el paso 2.9 para Drosophila / pez cebra larvas) a 18 vatios limpiador de aire de plasma utilizando el plasma en vacío bajo. Colocar las dos superficies de plasma tratado juntos y hornear en un horno de aire caliente a 50 ° C durante 2 horas. </li><li> Cortar el dispositivo unido desde el vidrio, agujeros de acceso en los depósitos de entrada y salida y el enlace a un cubreobjetos de vidrio (22 X 22 mm, N º 1 espesor) usando un limpiador de plasma como se ha mencionado en el paso 2,11. Esto produciría un dispositivo de inmovilización para el primer instar de larvas de Drosophila con una altura de canal de ~ 500 micras. Para las larvas de pez cebra, duplicar la capa espaciadora PDMS proceso de fabricación con una etapa de unión adicional. La doble capa de PDMS-S produce una altura de canal de 900 m para 30 HFP larvas de pez cebra. </li></ol> Precauciones: Evitar las partículas de polvo durante la fabricación del dispositivo. Dos plasma superficie limpiadas que estar completamente libre de polvo para la correcta adherencia. La tienda de los dispositivos en un desecador en situaciones en las que una habitación limpia especial no está disponible con el fin de minimizar la acumulación de partículas de polvo en los dispositivos. 4. Con membrana de PDMS <ol><li> Conectar un extremo de un tubo de micro-flex (diámetro interno 1,6 ~ mm, diámetro exterior ~ 4,8 mm) a un regulador de suministro de gas nitrógeno a presión y el otro extremo al depósito trampa principal a través de una aguja de calibre 18 (diámetro exterior ~ 1,25 mm) pegados al tubo. Una llave de paso 3-way utilizado en el medio de la conexión del tubo permite la aplicación o liberación de la presión sobre la membrana. </li><li> Llenar el tubo conectado al dispositivo de PDMS con una columna de 10 cm de agua destilada antes de conectarlo al depósito de la trampa principal de una C. elegans y / o Drosophila / pez cebra dispositivo larvas. </li><li> Girar la válvula de la fuente de nitrógeno a 14 psi leer y controlar la membrana de la trampa principal desviando hacia the canal de flujo a bajo aumento de un microscopio invertido. Longitud de la columna de agua en el tubo de micro-flex se comprime cada vez que la llave de paso de 3-vías está abierta. Los bordes de la membrana desviados son visibles en luz transmitida (Figura 1I y 1J). Deflexión membrana provoca el desplazamiento de las partículas de polvo / burbujas en la membrana de PDMS y los empuja a los límites de los canales. </li><li> Espere hasta que el frente del líquido llena el microcanal completamente sin aire atrapado. </li><li> Libere la presión mediante el uso de la llave de paso de 3 vías para relajar la membrana en su posición de reposo. </li></ol> 5. Inserción C. elegans, Drosophila y larvas de pez cebra en el dispositivo y los inmoviliza Bajo la membrana flexible PDMS <ol><li> Rellene el canal de flujo con M9 buffer [3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O a 1 L, esterilizar en autoclaving] para C. elegans 18 o 1X PBS [8 g de NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, 0,24 g de KH 2 PO 4, H 2 O para 1 L, esterilizar en autoclave] para Drosophila / pez cebra larvas 19 durante 10 min antes de una experimento. </li><li> Localizar un solo C. elegans de etapa requerida en una placa NGM 18 (o de primer instar de larvas de Drosophila de la placa de agar huevo o manualmente dechorionated 30 larvas de pez cebra hpf en medio líquido 20) utilizando un microscopio estereoscópico de baja magnificación. Elija un solo animal usando un pequeño volumen de solución tampón en una punta de micro. Utilice una punta de micro con su extremo cortado para dar cabida a la mayor Drosophila o larvas de pez cebra en el buffer. </li><li> Empuje el único organismo a través de la boca del canal de flujo. Ajustar la presión de pipeteado para colocar el animal en la trampa principal. </li><li> Aumentar la presión de la membrana de PDMS lentamente a la posición del animal contra la channel límite e inmovilizarlo con la presión de psi 14 para C. elegans, 7 psi para Drosophila y 3 psi para las larvas de pez cebra. </li><li> La posición del animal inmovilizado en el centro del campo de vista microscópico. El uso de un microscopio invertido con los ajustes deseados para alta resolución campo brillante o imágenes de fluorescencia. Adquirir imágenes de fluorescencia simple o lapso de tiempo a frecuencia de imagen predefinida. </li><li> Libere la presión trampa y controlar la locomoción de los animales durante 5-10 min a bajo aumento. </li><li> Enjuague el animal e inserte un animal fresco para repetir los pasos anteriores. </li><li> Lavar todos los animales desde el depósito de residuos utilizando agua destilada aplicada usando una jeringa. Secar el canal empujando el aire con una jeringa para la reutilización futura. </li></ol> Precauciones: Animales que requieren una mayor presión para pipetear líquidos dentro del cauce principal tienden a mostrar locomoción pobres / de salud después de salir de la trampa y se debe evitar por imaGing. Limpiar el canal de flujo de cualquier rastro de tampón para evitar la obstrucción de canal por los cristales. Si se utiliza aceite para obtener imágenes de alta resolución, limpiar el cubre de vidrio a ser capaz de mantener buena relación señal ruido para posteriores experimentos.

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+gene+unc-104+is+required+for+axonal+transport+of+synaptic+vesicles+in+C.+elegans.">Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans.</a> Cell. 65, 837-847 (1991).</li><li>Kumar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104/KIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo.">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).</li><li>Ou, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+cell+migration+in+C.+elegans+Q+neuroblasts.">Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts.</a> J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).</li><li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+bidirectional+mitochondrial+transport+is+coordinated+with+axonal+outgrowth.">The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth.</a> J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).</li><li>Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+imaging+conditions+on+mitochondrial+transport+and+length+in+larval+motor+axons+of+Drosophila.">Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).</li><li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

PDMS dispositivos microfluídicos son ópticamente transparentes por lo tanto se puede utilizar para la alta resolución en imágenes in vivo de cualquier organismo modelo transparente / translúcido. Nuestro diseño es adecuado para una gran ampliación espacio-temporal de imágenes de eventos celulares y subcelulares de animales vivos intactos. Microfabrication utilizando técnicas litográficas blandas permite la fácil manipulación de las dimensiones del dispositivo para diferentes tamaños de org...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Las obleas de silicio </td><td> Universidad oblea </td><td> 150 mm (100) Mech Grado SSP Si </td><td></td></tr><tr><td> Clewin Software </td><td> WieWeb software </td><td> Versión 2.90 </td><td></td></tr><tr><td> Plotter láser </td><td> Imagen Fine Line </td><td> 65.024 DPI </td><td></td></tr><tr><td> HMDS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 440191-100ML </td><td></td></tr><tr><td> SU8 </td><td> Microchem </td><td> SU8-2025, SU8-2050 </td><td></td></tr><tr><td> Revelador </td><td> Microchem </td><td> SU8 desarrollador </td><td></td></tr><tr><td> Silano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448931-10G </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> Lámpara UV </td><td> Mirador </td><td> 66943 </td><td> 200W Hg Oriel Light </td></tr><tr><td> Horno de aire caliente </td><td> Instrumentos Ultra </td><td> Una medida que se </td><td> A 50 ° C </td></tr><tr><td> Parrilla </td><td> Equipos de laboratorio IKA </td><td> 3810000 </td><td> <a href="http://www.ika.com" target="_blank">http://www.ika.com</a> </td></tr><tr><td> Plasma cleaner </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td></td></tr><tr><td> Hilandero </td><td> Sistemas de producción de semiconductores </td><td> SPIN150-NPP </td><td> <a href="http://www.SPS-Europe.com" target="_blank">www.SPS-Europe.com</a> </td></tr><tr><td> Vidrio cubreobjetos </td><td> Sello de Oro </td><td> 22 X 22 mm, N º 1 espesor </td><td></td></tr><tr><td>C. elegans </td><td> Caenorhabditis Centro de Genética (CGC) </td><td> e1265, ayIs4 </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila </td><td> Bloomington </td><td> P {} chaGAL4 / cyo, UAS-syt.eGFP </td><td></td></tr><tr><td> Pez cebra </td><td> Tipo salvaje de la India </td><td> Wild tipo </td><td></td></tr><tr><td> Tygon tubo </td><td> Sigma </td><td> Z279803 </td><td></td></tr><tr><td> Micro aguja </td><td> Sigma </td><td> Z118044 </td><td> Cortar en trozos de 1 cm </td></tr><tr><td> 3-way llave de paso </td><td> Sigma </td><td> S7521 </td><td></td></tr><tr><td> Harris pegador </td><td> Sigma </td><td> Z708631 </td><td></td></tr><tr><td> El gas comprimido nitrógeno </td><td> Proveedor local de gas </td><td></td><td> Utilice un regulador para controlar la presión </td></tr><tr><td> Microscopio estéreo &lt;/ Td&gt; <td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocal </td><td> Andor y Olympus </td><td> Yokogawa hilado disco microscopio confocal </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> Los Institutos Nacionales de la Salud </td><td> <a href="http://www.rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">www.rsbweb.nih.gov / ij</a> </td><td> Java programa basado en el procesamiento de imágenes </td></tr></tbody></table>

simple microfluidic devices for in vivo imaging of c. elegans, drosophila and zebrafish

Micro fabricadas dispositivos fluídicos proporcionar un micro-entorno accesible para estudios in vivo de pequeños organismos. Procesos de fabricación sencillos están disponibles para los dispositivos de microfluidos con técnicas de litografía blanda 1-3. Los dispositivos microfluídicos se han usado para la sub-celular de imagen 4,5, in vivo microcirugía láser 2,6 y 4,7 celular formación de imágenes. Imágenes in vivo requiere la inmovilización de los organismos. Esto se ha logrado mediante succión 5,8, 6,7,9 canales cónicos, membranas deformables 2-4,10, succión con refrigeración adicional 5, anestésico gas 11, geles sensibles a la temperatura 12, 13 y pegamento de cianoacrilato anestésicos tales como levamisol 14 , 15. Anestésicos usados ​​comúnmente influir en la transmisión sináptica 16,17 y se sabe que tienen efectos perjudiciales sobre la sub-celular neuronal transporte 4. En este study demostramos una membrana basada poli-dimetil-siloxano (PDMS), dispositivo que permite la inmovilización anestésico libre de organismos modelo intactas genéticos tales como Caenorhabditis elegans (C. elegans), larvas de Drosophila y larvas de pez cebra. Estos organismos modelo son adecuados para estudios in vivo en los dispositivos de microfluidos a causa de sus pequeños diámetros y cuerpos ópticamente transparentes o translúcidos. Diámetros del cuerpo van desde ~ 10 ~ 800 micras para micras para los primeros estadios larvales de C. elegans y larvas de pez cebra y requieren dispositivos de microfluidos de diferentes tamaños para lograr una inmovilización completa de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo. Estos organismos se inmovilizan mediante presión aplicada por gas nitrógeno comprimido a través de una columna de líquido y fotografiado usando un microscopio invertido. Animales liberados de la trampa de volver a la locomoción normal dentro de 10 min. Demostramos cuatro aplicaciones de time-lapse en C. elegansa saber, el transporte mitocondrial de imágenes en las neuronas, presináptica transporte de vesículas en un transporte defectuoso de transporte mutante del receptor de glutamato y la división Q neuroblast celular. Los datos obtenidos de tales películas muestran que la inmovilización de microfluidos es un medio útil y exacta de la adquisición de los datos in vivo de eventos celulares y subcelulares en comparación con los animales anestesiados (Figura 1J y 4 3C-F). Las dimensiones del dispositivo se han alterado para permitir imágenes a intervalos de tiempo de las diferentes etapas de C. elegans, Drosophila primer instar de larvas y larvas de pez cebra. El transporte de vesículas marcados con sinaptotagmina etiquetado con GFP (syt.eGFP) en las neuronas sensoriales muestra un movimiento dirigido de marcadores vesículas sinápticas colinérgicas expresados ​​en las neuronas sensoriales intactas larvas de primer instar Drosophila. Un dispositivo similar se ha utilizado para llevar a cabo el tiempo de imágenes a intervalos de latido del corazón en ~ 30 horas después de la fertilización (hpf)pez cebra larvas. Estos datos muestran que los dispositivos simples que hemos desarrollado puede ser aplicado a una variedad de sistemas modelo para estudiar varios fenómenos biológicos celulares y de desarrollo in vivo.

El dispositivo de inmovilización es una bicapa bloque PDMS fabricado mediante la unión de dos capas: una capa de flujo (capa 1) y una capa de control (capa 2) como se muestra en la figura 1. La trampa principal está conectado a un cilindro de gas nitrógeno a través de un regulador y una válvula de cierre 3-way para aplicar necesario (3-14 psi) de presión sobre la membrana a través de una columna de líquido (Figura 1A). La membrana desviada inmoviliza C. elegans, Drosophila<...

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Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Un dispositivo microfluídico simple ha sido desarrollado para realizar anestésico libre<em&gt; In vivo</em&gt; Formación de imágenes de<em&gt; C. elegans</em&gt;, Intacto<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas y larvas de pez cebra. El dispositivo utiliza una membrana de PDMS deformable para inmovilizar estos organismos modelo con el fin de realizar las imágenes de lapso de tiempo de numerosos procesos, tales como el ritmo cardíaco, la división celular y subcelular transporte neuronal. Se demuestra el uso de este dispositivo y muestran ejemplos de diferentes tipos de datos recogidos a partir de sistemas de modelos diferentes.

Simples dispositivos de microfluidos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Y pez cebra

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

17.0K vistas.  NCBS-TIFR. Un dispositivo microfluídico simple ha sido desarrollado para realizar anestésico libre In vivo Formación de imágenes de C. elegans, Intacto Drosophila Larvas y larvas de pez cebra. El dispositivo utiliza una membrana de PDMS deformable para inmovilizar estos organismos modelo con el fin de realizar las imágenes de lapso de tiempo de numerosos procesos, tales como el ritmo cardíaco, la división celular y subcelular trans...

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Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

Cuentas de la separación y las células en varios canales de dispositivos de microfluidos Con dielectroforesis y de flujo laminar

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Investigación

Bioingeniería

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Una técnica de microfluidos investigará Deformabilidad Cell

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Capa por capa deposición de colágeno en dispositivos de microfluidos para microtejidos Estabilización

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Estudios electrotaxis de pulmón células de cáncer utilizando un Multicanal Dual-campo eléctrico chip de microfluidos

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

El uso de adhesivo Patrones para construir dispositivos de microfluidos de papel 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Múltiples pasos Fotolitografia variable Altura de múltiples capas con válvula dispositivos de microfluidos

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

La fabricación de dispositivos de microfluidos basados ​​en papel tridimensional para inmunoensayos

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polidimetilsiloxano-policarbonato celular dispositivos de microfluidos para Estudios de Inmigración en virtud perpendicular Química y gradientes de oxígeno

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices cannot be worn under everyday conditions. Therefore, textiles are commonly considered the best substrate to accommodate electronic devices in wearable use. In this paper, we describe how to selectively pattern organic electroactive materials on textiles from a solution in an easy and scalable manner. This versatile deposition technique enables the fabrication of wearable organic electronic devices on clothes.

In this paper, we present a protocol to selectively deposit organic materials on textiles, which allows for the direct integration of organic electronic devices with wearables. The fabricated devices can be fully integrated in textiles, respecting their mechanical appearance and enabling sensing capabilities.

Un método de fabricación simple y escalable para dispositivos electrónicos orgánicos sobre los Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Una plataforma de microfluidos para la proyección de imagen Longitudinal en Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...