La Sociedad Max Planck y un estipendio Göttingen Escuela Juvenil Grupo de HB financiaron este trabajo.

1. Los instrumentos, medios de cultivo, y platos <ol><li> Utilice un microscopio que es capaz de mantener la muestra en el foco y que está equipado con una etapa automática. Construir un calentador tapa a medida o comprar una solución comercial. Configurar una-EMCCD LED sistema de cámara en la que la exposición de la cámara desencadena LED de iluminación a través de una señal TTL utilizando las instrucciones del fabricante. Nota: Ver Discusión para más detalles. </li><li> Polydimethylsiloxan (PDMS) sellos: <ol><li> Fabrique PDMS sellos en un centro de microfluidos o tiene los sellos de PDMS producido por una fundición comercial. Para utilizar una fundición comercial, enviar un archivo de autocad a la empresa y especificar la profundidad (15 micras, por ejemplo) del dispositivo. Después de la entrega de la fundición, cortar el chip PDMS en sus 16 sellos utilizando un bisturí. </li><li> Bond cada sello individual a un portaobjetos de vidrio utilizando plasma de aire. Para la unión, exponer tanto el sello de PDMS y el portaobjetos de vidrio con el plasma de aire para unpelea de 1 min (utilizando la configuración de plasma más altos en el 0,5 mbar). Asegúrese de que las superficies de unión frente al alza durante el tratamiento de plasma. Luego, coloque el sello PDMS sobre el portaobjetos de vidrio. </li></ol></li><li> Tome una 3,5 cm plato inferior y cortar un área cuadrada de 18 x 18 mm desde el centro de la parte inferior de la cápsula, utilizando una máquina de fresado vertical y cortadores rotativos afilados. Utilice baja velocidad de rotación del cortador y la alimentación lenta para evitar que el plástico de la fusión debido al calor producido por la fricción. Prepare varios platos a la vez. Nota: El plato de fondo puede ser reutilizado muchas veces después del experimento si se limpia después de la inmersión en etanol puro O / N. </li><li> Agarosa: <ol><li> Disolver 3 g de alto punto de fusión de agarosa en 100 ml S-basal (5,85 g de NaCl, 1 g K 2 HPO 4, 6 g de KH 2 PO 4, 1 ml de colesterol (5 mg / ml en etanol), H 2 O a 1 L, esterilizar en autoclave) por ebullición. Hacer alícuotas de la agarosa disuelta en 2 ml tubos Eppendorf y store. Además, preparar un lote de agarosa de bajo punto de fusión exactamente de la misma manera como el punto de agarosa alto punto de fusión. </li><li> Antes de su uso, coloque 3 alícuotas de alto punto de fusión de agarosa en un bloque de calentamiento a 95-98 ° C. Antes de su uso, coloque una alícuota de bajo punto de fusión de agarosa en un bloque de calentamiento a 95-98 ° C hasta que se haya derretido y luego en un bloque de calentamiento a 30 - 35 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Selección de los Animales <ol><li> Crecer gusanos a una densidad baja en placas NGM semilla para obtener animales limpios. Asegúrese de que hay un montón de comida y sólo unos pocos animales en el plato. </li><li> Para imágenes larvas L1, la transferencia de unos 30 huevos que contienen embriones en la etapa de pretzel en una placa de NGM sembrado fresco. Para la transferencia de fases larvarias tarde o adultos C. elegans, traslado de unos 30 gusanos en una placa de NGM sembrado fresco. </li></ol> 3. Preparación de agarosa microcámaras <ol><li> Preparación de la cápsula: <ol><li>Tome un plato de plástico con una abertura cuadrada de 18 x 18 mm en la parte inferior y colocarlo boca abajo con la abertura hacia arriba. Cierre la apertura mediante la colocación de una pieza de doble cara cinta adhesiva de 20 x 20 mm en la abertura. Girar el plato alrededor de modo que la cinta adhesiva está en la parte inferior y colocar el plato sobre una superficie dura. Corte la abertura gratis con un bisturí. </li><li> Con una pipeta P1000, llenar 2 ml de 3% de agarosa de alta fusión en S-basal en el plato. Coloque la agarosa en el área que rodea la abertura y dejar que solidifique. Espere hasta que la agarosa es sólido. </li><li> Date la vuelta el plato y se desprenda la película protectora que cubre la cinta adhesiva de doble cara para que el lado adhesivo permanecerá en el plato y será expuesto. Nota: Como resultado de ello, un fino anillo de cinta adhesiva rodeará la parte exterior de la abertura. La agarosa sirve como un depósito de humedad que luego rodear la muestra. </li></ol></li><li> Casting de microcámaras: <ol><li> Exponga ªsuperficie PDMS correo para moldear con plasma de aire de 20 a 60 seg. Nota: Este tratamiento de plasma hace que los PDMS superficie hidrófila, lo que impide el atrapamiento de burbujas de aire y produce impresiones más nítidas. </li><li> Construir dos espaciadores de igual altura apilando 5-9 portaobjetos de vidrio. Place, en paralelo a sus lados largos, la primera pila espaciador, a continuación, un único portaobjetos de vidrio, y luego de nuevo una pila espaciador. Colocar el portaobjetos de vidrio que contiene el sello PDMS ortogonalmente a través de los espaciadores. Ajustar la altura de los espaciadores de modo que hay un espacio de aproximadamente 1,5 mm entre la superficie de moldeo del sello PDMS y el portaobjetos de vidrio individual. </li><li> Coloque una gota de líquido caliente de agarosa de alto punto de fusión en el portaobjetos de vidrio sola cerca del sello de PDMS y rápidamente se deslizan los PDMS sello verticalmente en la agarosa líquida. Deje que la agarosa solidifique. Compruebe que se pone una apariencia opaca, que por lo general toma alrededor de 2 min. Retire el sello verticalmente con un movimiento. Nota: Es conveniente glue el separador se desliza junto con cinta adhesiva de doble cara. El movimiento vertical del sello evita que burbujas de aire de quedar atrapado en la agarosa. </li></ol></li><li> La transferencia de los huevos o gusanos junto con bacterias OP50 en la agarosa usando un pico fino alambre de platino. Distribuir un huevo o un gusano por cámara junto con alimentos utilizando una pestaña. Rellene alrededor de 30 huevos en una sola plataforma de agarosa. </li><li> Cortar la losa de agarosa que contiene las microcámaras llenos en un cuadrado de aproximadamente 15 x 15 mm de modo que encaja muy bien en la apertura del plato. Recoge la losa de agarosa plaza con unas pinzas y colóquela boca abajo sobre un cubreobjetos de vidrio de 20 x 20 mm. Una vez caído, no levante de nuevo o deslice alrededor porque esto puede causar que las bacterias y gusanos para ser empujado fuera de sus cámaras. </li><li> Asamblea del plato: <ol><li> Coloque el cubreobjetos de vidrio sobre la abertura de la placa de plástico. Presione suavemente el cubreobjetos de vidrio sobre el anillo hecho de cinta adhesiva de doble cara.Tenga cuidado de no romper el vidrio. </li><li> Gire el plato boca abajo y utilizar una pipeta P1000 para llenar la brecha entre la losa de agar que contiene las microcámaras y el depósito de agarosa con el líquido de agarosa de bajo punto de fusión se enfría a aproximadamente 30 ° C. Espere hasta que la agarosa se ha solidificado. </li><li> Sellar el plato con una tapa. Para microscopios invertidos utilizar una tapa calentada. Para microscopios verticales utilizar una tapa normal y sellar el plato con Parafilm. </li></ol></li><li> Después de terminar la preparación de microcámaras, echa bajo un microscopio estereoscópico. El llenado correcto es crucial. Véase la discusión para más detalles. </li></ol> Imagen 4. Calcio <ol><li> Utilice cepas transgénicas que expresan sensores de calcio codificados genéticamente como HBR16 (goeIs5 [PNMR-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: UNC-54-3&#39;UTR, UNC-119 (+)]) 27. </li><li> Utilice un microscopio compuesto equipado para campo amplio de epifluorescencia. Conecte la salida TTL de la cámara a EMCCDla entrada de TTL del LED, de modo que cada vez que la cámara graba un marco de la muestra se iluminará. Utilice un tiempo de exposición de unos 5 ms. Utilice ganancia EM en el rango de 50 a 300. </li><li> Especifique una película estallido funcionamiento durante 24 horas con cada gusano se toman las radiografías cada 15 - 30 min primero durante 20 segundos con la CID, a continuación, durante 20 s con una fluorescencia de GFP para grabar GCaMP y, a continuación, tomar una imagen final de la señal mKate2 se toma para de control para los niveles de expresión. Utilice una velocidad de 2 / seg durante cada ráfaga. </li><li> Para la inspección visual de los datos, usar un mapa en color falso para mejorar la visibilidad de pequeños cambios en la intensidad de fluorescencia. Datos fluorescentes trama como Df / F, con F es el valor promedio de la línea base de la fluorescencia. Una descripción detallada de análisis de datos de calcio se puede encontrar en la literatura 20. </li></ol> 5. Paralelo AMI de Múltiples Worms <ol><li> Coloque el plato que contiene las microcámaras en el microscopio, se centran en la muestra y realizar la autofocus. Establecer un protocolo de software para que la cámara adquiere una ráfaga de 40 cuadros de imagen en 20 segundos cada media hora durante 24 horas, lo que se traducirá en 1.920 fotogramas por gusano, una cantidad razonable de datos. Configurar la exploración de modo que visita cada gusano utilizando el escenario. Apunte para filmar unos 30 gusanos en una carrera. </li><li> Imagen de varios gusanos por reducir el zoom, es decir, mediante un aumento menor. Use un aumento menor para cubrir varios microcámaras con el chip de la cámara y filmar varias microcámaras adyacentes al mismo tiempo. Tras el final de la adquisición de imágenes, separar los datos de cada cámara individual por recorte de una región de interés que cubre un animal. </li><li> Para evaluar rápidamente los datos de movilidad, utilice la resta marco de 28-32. </li></ol> 6. Imaging Etapas de la vida diferente de C. elegans <ol><li> Utilice microcámaras de agarosa para todas las etapas de vida de C. elegans de L1 a adultos y entre ellos dauers. Utilice las dimensiones de la cámara apropiados para el DIFrentes etapas de la vida que se muestran en la Tabla 1. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Etapa de la vida </td><td> Tamaño de Cámara </td><td> Profundidad de la cámara </td><td> Tiempo de grabación normal </td><td> Aumento </td></tr><tr><td> L1 </td><td> 190 x 190 micras </td><td> 10 - 15 micras </td><td> huevo - mediados L2 </td><td> 400X </td></tr><tr><td> L2 </td><td> 370 x 370 micras </td><td> 15 micras </td><td> huevo - L3 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> Dauer larvas </td><td> 370 x 370 micras </td><td> 25 micras </td><td> 4 dias </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L3 </td><td> 700 x 700 micras </td><td> 45 micras </td><td> L2 - L4 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L4 </td><td> 700 x 700 micras </td><td> 45 micras </td><td> joven L4 - adulto joven </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Adultos jóvenes </td><td> 700 x 700 micras </td><td> 45 micras </td&gt; <td> 12-24 h </td><td> 100X </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Cámara tamaños para diferentes etapas de la vida. Se muestran dimensiones de la cámara y aumentos que son útiles para diversas etapas optimizados para un chip de cámara de 8 x 8 mm.

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2012).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10, 877-879 (2013).</li><li>Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+tracking+and+behavioral+measurement.">C. elegans tracking and behavioral measurement.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e4094 (2012).</li><li>Yemini, E., Kerr, R. A., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+movement+behavior+of+multiple+worms+on+food.">Tracking movement behavior of multiple worms on food.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1483-1487 (2011).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in.">High-throughput behavioral analysis in.</a> C. elegans. Nature Methods. 8, 592-598 (2011).</li><li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parallel+Worm+Tracker:+a+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes.">The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PLoS One. 3, e2208 (2008).</li><li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, E4266-E4273 (2013).</li><li>Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+hydrogel+microcompartments+for+imaging+sleep-+and+wake-like+behavior+and+nervous+system+development+in+Caenorhabditis+elegans+larvae.">Agarose hydrogel microcompartments for imaging sleep- and wake-like behavior and nervous system development in Caenorhabditis elegans larvae.</a> Journal of Neuroscience Methods. 201, 78-88 (2011).</li><li>Yu, C. C., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-well+imaging+of+development+and+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 223, 35-39 (2014).</li><li>Luke, C. J., Niehaus, J. Z., O'Reilly, L. P., Watkins, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-microfluidic+methods+for+imaging+live.">Non-microfluidic methods for imaging live.</a> C. elegans. Methods. 68, 542-547 (2014).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , 1-19 (2013).</li><li>Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+microfluidic+system+for+individual+Caenorhabditis+elegans+assay.">Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay.</a> Lab Chip. 8, 1432-1435 (2008).</li><li>Krajniak, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+high-resolution+imaging+and+culture+of+C.+elegans+in+chip-gel+hybrid+microfluidic+device+for+developmental+studies.">Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies.</a> Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of.</a> C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).</li><li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+C.+elegans+mechanosensory+neurons+demonstrates+a+specific+role+for+the+MEC-4+channel+in+the+process+of+gentle+touch+sensation.">In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation.</a> Neuron. 39, 1005-1017 (2003).</li><li>Hilliard, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+C.+elegans+ASH+neurons:+cellular+response+and+adaptation+to+chemical+repellents.">In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents.</a> EMBO Journal. 24, 63-72 (2005).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+voltage-gated+calcium+channel+subunit+genes+on+calcium+influx+in+cultured+C.+elegans+mechanosensory+neurons.">Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons.</a> Journal of Neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).</li><li>Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles.">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. , 1-13 (2006).</li><li>Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+quantitative+Ca2++measurements+using+improved+cameleons.">Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96, 2135-2140 (1999).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6 (2), (2013).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+molecular+solution+for+ultraviolet+light+detection+in+Caenorhabditis+elegans.">A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, e198 (2008).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nat Neurosci. 11, 916-922 (2008).</li><li>Turek, M., Lewandrowski, I., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP2+transcription+factor+is+required+for+a+sleep-active+neuron+to+induce+sleep-like+quiescence+in.">An AP2 transcription factor is required for a sleep-active neuron to induce sleep-like quiescence in.</a> C. elegans. Current Biology. 23, 2215-2223 (2013).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Notch+Signaling+Regulates+Adult+Chemosensory+Response+and+Larval+Molting+Quiescence.">C. elegans Notch Signaling Regulates Adult Chemosensory Response and Larval Molting Quiescence.</a> Current Biology. 21, 825-834 (2011).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451, 569-572 (2008).</li><li>Iwanir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+C.+elegans+behavior+during+lethargus:+homeostatic+bout+dynamics,+a+typical+body+posture,+and+regulation+by+a+central+neuron.">The microarchitecture of C. elegans behavior during lethargus: homeostatic bout dynamics, a typical body posture, and regulation by a central neuron.</a> Sleep. 36, 385-395 (2013).</li><li>Nagy, S., Raizen, D. M., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+behavioral+quiescence+in+Caenorhabditis+elegans.">Measurements of behavioral quiescence in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. , (2014).</li><li>Nagy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+of+Caenorhabditis+elegans+larvae+reveals+a+novel+locomotion+switch,+regulated+by+Galphas+signaling.">A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling.</a> eLife. 2, e00782 (2013).</li><li>Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dauerlarva,+a+post-embryonic+developmental+variant+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 46, 326-342 (1975).</li><li>Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+activity+of+a+sensory+neuron+during+a+sleep-like+state+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 21, R983-R984 (2011).</li><li>Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus.">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1, 12-14 (2012).</li><li>Schwarz, J., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sleep-like+quiescence+in+both+hyperactive+and+hypoactive+mutants+of+the+Galphaq+Gene+egl-30+during+lethargus+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 8, e75853 (2013).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Hardware El enfoque de un microscopio típicamente irá a la deriva durante la adquisición de imagen a largo plazo. Para microscopios compuestos, foco de mantenimiento de los sistemas se pueden comprar en los principales fabricantes de microscopios. En el caso de un microscopio compuesto con control de enfoque es demasiado caro, una alternativa sencilla sería utilizar un estereomicroscopio. Los microscopios compuestos permiten el uso de objetivos con alta apertura numérica (NA) y se puede automatizar fácilmente. Objetivos 40X petróleo son muy adecuadas. Lentes de inmersión de agua no son ideales debido a la evaporación durante la exploración a largo plazo. De contraste de interferencia diferencial (DIC) genera un contraste agradable que ayuda a seguir los cambios morfológicos y de comportamiento, pero las imágenes de campo brillante sencilla también se puede utilizar. Para DIC o imágenes de campo claro, utilizar la luz roja colocando un filtro de luz roja en el camino dia-iluminación del microscopio. Para la exploración de varios microcámaras una etapa automatizado es necesario. Mejor rendimiento es achieved cuando se utiliza una etapa que tiene la aceleración lineal y desaceleración y se puede ajustar a la baja velocidad de exploración para evitar molestar a los animales durante la exploración. No hemos observado respuestas conductuales o aumento de calcio en las neuronas mechanosensitive (ALM y PLM) durante la exploración, lo que sugiere que la exploración lenta de hecho no se activa el sistema mechanosensitive del gusano (datos no mostrados). Sistemas LED comerciales pueden ser utilizados. Varias compañías ofrecen soluciones listas para el uso que incluyen los LEDs en diferentes longitudes de onda. El LED debe tener la opción de activar externamente el LED con una señal TTL. Se necesita una cámara altamente sensible para la formación de imágenes de calcio de los animales en movimiento. Cámaras EMCCD son las cámaras más sensibles en el mercado. La cámara tiene que tener una salida TTL durante la exposición (también llamada de salida &quot;fuego&quot;). Se requiere un calentador de tapa para evitar la condensación en la tapa si se utiliza un microscopio invertido. En un microscopio vertical, se colocará el plato de manera que el wi tapall estar en el fondo y por lo tanto se evita la condensación y no se requiere calefacción tapa. La tapa bien debería cerrar el plato para evitar la evaporación del agua durante la exploración a largo plazo. PDMS sellos La superficie del sello PDMS que contiene la estructura para el moldeo de la agarosa se enfrenta lejos de la lámina de vidrio, que soporta el sello PDMS. Una lista con las empresas que ofrecen los chips de microfluidos personalizada se puede encontrar en Wikipedia ( <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies" target="_blank">http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies</a> ). Llenar los nematodos en sus cámaras Este es el paso más crítico en el protocolo y los siguientes puntos deben ser considerados: A) La humedad de la agarosa es crucial para la transferencia de los gusanos y de imágenes. Si la agarosa es demasiado húmedo, es decir, hay un líquido covEring un área de varios microcámaras, no será posible distribuir alimentos bacteriana y gusanos de una manera controlada porque el líquido hará que las bacterias fluyen de distancia. Si la agarosa es demasiado seco entonces las bacterias y gusanos no pueden bajar el pick fácilmente lo que significa que el aumento de la fuerza debe ser utilizada para retirar los gusanos y bacterias que causan daño a la facilidad de agarosa. Al rellenar un montón de gusanos la agarosa puede secarse. En el peor de los casos la agarosa será tan seco en el extremo de que las cámaras se derrumbarán. Si la agarosa es demasiado seco puede ser rehidratado mediante la colocación de una pequeña gota (aproximadamente 2 l) de S-Basal sobre el lado del chip, donde no hay gusanos. Sumergir el alambre de platino recoger en el líquido e incluso tirar un poco de líquido en la zona donde las cámaras están llenas de gusanos. B) La cantidad de alimentos es fundamental para la imagen de éxito a largo plazo. Si no hay suficiente comida, los gusanos pueden quedarse sin ella. Si hay excesiva de alimentos de la cavidad de la cámara deno se comportan como un líquido sino más bien como un sólido y permitirá gusanos escapen de la cámara presionando las bacterias. Objetivo de obtener una suspensión bacteriana que llena toda la cámara. Los gusanos están en constante contacto físico con la superficie del agar y el vidrio a lo largo de la mayor parte de su longitud durante el experimento y el comportamiento de rastreo parece ser similar al movimiento en un plato y diferente a golear en líquido. C) Mecánica perjudicial de la agarosa puede arruinar el experimento. Una selección fina es esencial. No debe tener esquinas afiladas. Una pestaña suave unido a una punta de pipeta puede ser utilizado para mover las bacterias o los gusanos en las cámaras en lugar de utilizar una selección de platino. En la mayoría de casos, sin embargo, agarosa sobresecada es la razón de daños. La selección de pestañas o deberían, idealmente, sólo apenas tocar la agarosa en sí, y la película de agua sobre la superficie de agarosa debe sacar gusanos y bacterias. Cuando el sellado de las cámaras, de nuevo, la humedad de la agarosa es esencial. No deberíaser cualquier líquido libre en la superficie de agarosa porque esto puede lavar bacterias y gusanos durante el sellado. Las burbujas grandes pueden ser removidos por levantando suavemente una esquina de la losa de agar. Burbujas pequeñas que son menores que la cámara a menudo quedan atrapados dentro de las cámaras. Estas burbujas no son un problema y desaparecerán por absorción. Después de montar el plato, puedes volver a que la agarosa no es demasiado seco o demasiado húmedo. Las cámaras deben estar bien sellados y no debe haber ningún flujo de líquido entre las cámaras. Si la agarosa es demasiado húmeda, las cámaras no sellan correctamente. Los gusanos pueden escapar o su comida serán arrasadas. Si la muestra es demasiado húmedo, sencillo abrir la tapa y dejar secar agarosa durante un minuto o dos. Si la agarosa es demasiado seco, las cámaras pueden colapsar y los gusanos se escaparán. La ampliación de zoom se aleja Para imágenes de fluorescencia, reducir el zoom está limitada por la baja cantidad de luz obtenida a ampliaciones inferiores. También, EMCCD cámaras están optimizados para la sensibilidad y a menudo tienen una resolución relativamente baja. Sin embargo, la ampliación de imagen cuatro veces es bien posible. Por ejemplo, cuatro cámaras de 190 micras x 190 micras pueden caber en un fotograma utilizando 140X aumentos (logrado mediante el uso de un 20X Objetivo y una cámara 0.7X montaje) y un píxel de 512 x 512, 8 x 8 mm cámara. Una cámara de alta resolución con un chip grande (como cámaras sCMOS, 16,6 mm de chips x 14 mm, 2.560 x 2.560 píxeles = 5,5 megapíxeles) optimiza la ampliación de la CID y la imagen de campo claro. Por ejemplo, hasta 30 gusanos L1 en 190 micras x 190 micras cámaras pueden caber en cada marco de esta cámara cuando se utiliza un aumento de 100X (ver Figura 3). En principio, el zoom y el análisis también se pueden combinar para obtener incluso un mayor número de animales. La mayoría de las neuronas permanecen bastante bien en el foco, de modo que sólo un plano focal necesita ser fotografiado. Si se encuentran las neuronas que salir del foco, az exploración utilizando una unidad piezo se pueden tomar en cada tiempo pmixto. La adaptación a diferentes comportamientos Este protocolo da una buena idea de la conducta a través de escalas de tiempo largos. Obviamente, la temporización de las ráfagas necesita ser adaptado a diferentes comportamientos y etapas de la vida. Limitaciones de la técnica Hay varios factores que limitan la duración de la imagen. El más importante es la cantidad de comida. Una vez que se consume la comida, las larvas dejan de desarrollarse. Así, en pequeñas cámaras (190 x 190 m) gusanos se desarrollan hasta la etapa L3 y luego arrestan. Si se requiere mayor tiempo de formación de imágenes, las cámaras más grandes tienen que ser utilizados. La duración máxima de formación de imágenes a largo plazo está en el intervalo de 2,5 - 3 días. Si se requiere más tiempo de formación de imágenes, los gusanos necesitan ser recuperado y se colocaron en cámaras nuevas. Cuando la formación de imágenes gusanos adultos, otra limitación es causada por la descendencia de estos gusanos. Los gusanos adultos ponen huevos de larvas que eclosionan. Estas larvas también se quedará dentro de la cámara, Consumir alimentos, y puede perturbar el análisis de imágenes. Si descendencia es un problema, una solución es utilizar ya sea adultos estériles o para colocar repetidamente los gusanos en cámaras frescas. Para recuperar los gusanos, la losa de agarosa que contiene la cámara se corta libre con un bisturí, se tira de la cubreobjetos, y se coloca en una placa de NGM de la que los gusanos se pueden recuperar. Otro límite es la restricción de los gusanos a áreas relativamente pequeñas. Esto puede ser un problema si el movimiento de largo alcance debe ser analizado. Mientras que los animales en las cámaras pueden ser estimulados mecánicamente y optogenetically 21,27,34,35, la naturaleza sellada de la cámara hará que sea difícil de aplicar estimulantes solubles o volátiles. Los gases biológicamente importantes, tales como oxígeno o dióxido de carbono pueden difundir libremente en el agar. El gran depósito de aire en el plato debe mantener las concentraciones de gas en las cámaras constante durante el tiempo necesario para los experimentos. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el concentratio local de oxígenon en la cámara pueden parecerse más a las condiciones que se encuentran en cultivo líquido de la cultura en el plato. Importancia en relación con los métodos existentes Dispositivos de microfluidos han avanzado mucho en el desarrollo del comportamiento y estudiado en C. elegans. A menudo, las estructuras de microfluidos están hechas de PDMS 12. Aquí se describe un protocolo para la generación de cámaras de cultivo de microfluidos hechos de agarosa. La fuerza de esta técnica es la combinación de una alta calidad de imagen, la correlación de la conducta con las mediciones fisiológicas, de imágenes a largo plazo, y un razonablemente alto rendimiento. Alta calidad de imagen se consigue mediante la formación de imágenes a través de la cubreobjetos utilizando altos objetivos de NA. Como resultado, imágenes de fluorescencia tales como imágenes de calcio y de formación de imágenes confocal de las estructuras subcelulares se puede realizar. Debido a que los animales no se inmovilizan como en otros sistemas, que permite una correlación de comportamiento con las mediciones fisiológicas. Because los animales tienen alimentos suficientes, continúan desarrollando permitiendo imágenes a largo plazo. Este sistema puede imagen muchos gusanos en una carrera porque los animales están restringidos a sus cámaras definidas. Por lo tanto, este método se puede escalar fácilmente hasta 9,27,34-36. Las futuras aplicaciones Hasta ahora, este sistema se ha utilizado principalmente para estudiar el comportamiento del sueño en C. elegans larvas L1. Sin embargo, la adaptación a todas las etapas hará posible el estudio de una amplia gama de comportamientos también en dauers y adultos. Una amplia gama de comportamientos se puede estudiar con esta técnica desde el apareamiento de la puesta de huevos.

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments. 
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24. 
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip. 
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>high-melting point agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP(E)164-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Vision Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED system</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compound microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon 897</td>
			<td>now sold as iXon Ultra 897</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>PDC-23G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lid heater</td>
			<td>MPI workshop</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stage for the microscope</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Nano Scan Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x-y-stage for the microscope</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Proscan III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stamp</td>
			<td>Abbott Laboratories&#160;</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red light filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET660/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td colspan="2">Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided sticky tape</td>
			<td>Sellotape/Henkel</td>
			<td>double sided 12mm x 33 m</td>
			<td>alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans

El comportamiento es controlado por el sistema nervioso. El calcio de imágenes es un método directo en el nematodo Caenorhabditis elegans transparente para medir la actividad de las neuronas durante varios comportamientos. Para correlacionar la actividad neural con el comportamiento, el animal no debe ser inmovilizado, pero debe ser capaz de moverse. Muchos cambios de comportamiento ocurren durante escalas de tiempo largos y requieren grabar durante muchas horas de comportamiento. Esto también hace que sea necesario para la cultura de los gusanos en la presencia de alimentos. ¿Cómo pueden los gusanos cultivarse y su actividad neuronal fotografiado en escalas de tiempo largas? Agarosa Microcámara Imaging (IAM) fue desarrollado previamente a la cultura y observar pequeñas larvas y ahora se ha adaptado para estudiar todas las etapas de la vida desde la primera L1 hasta la etapa adulta de C. elegans. AMI se puede realizar en varias etapas de la vida de C. elegans. Imágenes de calcio a largo plazo se logra sin inmovilizar a los animales mediante el uso de las exposiciones a corto provocados externamente comcombinado con un electrón multiplicando la grabación del dispositivo (EMCCD) cámara de carga acoplada. Alejar o exploración puede ampliar este método a la imagen hasta 40 gusanos en paralelo. Por lo tanto, se describe un método para el comportamiento y la actividad neural imagen en escalas de tiempo largas en todas las etapas de vida de C. elegans.

Microcámaras de agarosa se ​​pueden aplicar a cualquier etapa de la vida de C. elegans. Como puede verse en la Figura 1A, el desarrollo larval y el comportamiento durante el sueño L1 lethargus pueden ser observados. Se muestran los tamaños de cámara que son 190 x 190 m, 10 m de profundidad. Si se requieren escalas de tiempo más largas, se pueden utilizar cámaras más grandes. Como puede verse en la Figura 1B, utilizando una cámara con dimensiones más grandes (370 x 370 m, 25 m de profundidad) permite el desarrollo de C. elegans desde el huevo hasta adulto. La Figura 1C muestra un análisis de los cambios a largo plazo en el comportamiento utilizando sustracción marco de un gusano crecido en una cámara de huevo hasta adulto. Se muestra son intensidades medias después de la sustracción del marco de las explosiones seleccionados durante la vigilia y lethargus. Cuanto menor es la intensidad media de los valores después de la resta marco es, menor es la movilidad del gusano. Se muestra se seleccionan los rastros de ráfaga de una condición estela y una condición lethargus por etapa larval. Losaumento observado en la intensidad media durante el desarrollo se debe principalmente a un aumento de contraste y el tamaño del animal. La Figura 1D muestra una larva dauer, una etapa de la vida alternativa que se dedica durante condiciones ambientales adversas 33. Tamaño de la cámara es de 370 x 370 m, 15 m de profundidad. Tenga en cuenta que la larva dauer se colocó en la cámara sin alimentos bacteriana, lo que provocaría la salida de la etapa larval dauer. La Figura 1E muestra un gusano adulto que ya ha establecido muchos huevos en la cámara. Dimensiones de la cámara se utilizan para el adulto son 700 x 700 m, 45 m de profundidad. Por último, la Figura 1F muestra un hermafrodita adulto y un apareamiento masculino dentro de una cámara de adultos. Imágenes de calcio en los gusanos móviles es posible con sensores de calcio GCaMP. Figuras 2A, B muestran imágenes de calcio del comando interneuron AVA para una larva L1 27. Figuras 2C, D muestran la actividad de calcio para la saMe tipo de neurona en un animal adulto. La ampliación de imagen a largo plazo es posible gracias a la digitalización y alejando el zoom. Figura 3A muestra la calidad de imagen de las imágenes simultánea de 30 gusanos en un único chip de la cámara con una cámara de 5 megapíxeles. La figura 3B muestra la calidad de imagen de 4 gusanos calcio fotografiado simultáneamente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1. Adaptación del IAM a todas las etapas de vida de C. elegans. (A) Larva fotografiado desde la primera hasta L1 L2 etapa temprana en 190 x 190 micras cámaras. (B) El desarrollo de huevo hasta adulto en una cámara de 370 x 370 m. (C) La movilidad de un gusano evaluó mediante la resta marco. Se muestra la intensidad media de todas las imágenes de la imagen después de la sustracción del marco para una película de ráfaga seleccionado para cada sta larvalge para despertar y el comportamiento lethargus. (D) Una larva dauer en ausencia de alimentos en una cámara de 370 micras x 370. Hermafrodita (E) para adultos con muchos huevos puestos en una cámara de 700 x 700 m. (F) El apareamiento de un macho y una hermafrodita en el interior de una cámara de 700 x 700 m. YA significa adulto joven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. El calcio de imágenes con IAM. (A) de imágenes de calcio con GCaMP3 en el interneuron comando AVA de larvas L1 usando el promotor de RMN-1. Se muestran dos imágenes en falso color. En la imagen izquierda, la actividad de AVA es baja y el gusano no está haciendo un movimiento hacia atrás. En la imagen de la derecha de la actividad de AVA es<html> de altura, y el gusano se está moviendo hacia atrás. transitorios (B) de calcio en el tiempo para un gusano de L1. (C, D) los transitorios de calcio en un animal adulto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. Imaging varios gusanos en paralelo por el zoom a cabo. (A) de imágenes simultánea de 30 gusanos L1 por fotograma utilizando 190 x 190 micras cámaras y un aumento de 100X (usando un objetivo 10X) y un chip de la cámara 16,6 x 14 mm. (B) de formación de imágenes simultánea de cuatro gusanos L3 por trama utilizando 370 x 370 micras cámaras y un aumento de 100X y una región de interés de un chip de la cámara 16,6 x 14 mm.et = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Watch this Scientific Journal Video about Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microcámaras de agarosa para Imagen de calcio a largo plazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

9.4K vistas.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry. Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans. 

Video: Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans de aprendizaje positivo butanona, a corto plazo y largo plazo Ensayos de la memoria asociativa

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Investigación

Neurociencias

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativa en<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

La<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para el Estudio Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Métodos para el estudio de los mecanismos de acción de los fármacos antipsicóticos en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

Seguimiento del comportamiento a largo plazo de Libremente Natación débilmente eléctrico Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

UN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensayo de aversión al cobre basado en el estado nutricional

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Generación y Mantenimiento a Largo Plazo de Nervios<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...