Este protocolo describe el método para la caracterización molecular completa e imparcial de una sola muestra utilizando ambas espectrometría de masas, utilizando metabolómica, proteómica y lipidómica, y plataformas de espectroscopia de resonancia magnética nuclear. La importancia de este enfoque es que podemos caracterizar un sistema biológico aguas abajo del genoma, a través de la identificación de diferentes tipos de moléculas, lo que nos permite inferir vías metabólicas y de descomposición. Técnica de extracción secuencial, permite la extracción de compuestos polares biodisponibles utilizando agua, seguido de MPLEx para capturar cualquier compuesto o metabolitos polares adicionales, así como proteínas y lípidos de una sola muestra.
La demostración visual de este método es crítica porque guía al científico a través de la separación de las tres capas durante el segundo paso de extracción, y la división de los extractos entre diferentes instrumentos de análisis. Los análisis multiómicos integrados potencian investigaciones más eficaces y una comprensión completa de los sistemas biológicos complejos. Este método robusto extrae una amplia diversidad de moléculas y es aplicable a diversos tipos de muestras.
Comience este procedimiento con la recopilación y preparación de los ejemplos como se describe en el protocolo de texto. Usando un utensilio de acero inoxidable lavado con etanol, aliquot 50 miligramos de cada una de las muestras secas en tubos individuales de vidrio de dos mililitros. Añadir un mililitro de agua destilada y desgasificación a cada muestra.
A continuación, tapar los viales y agitar durante dos horas en una mesa de coctelera. Centrifugar las muestras a 15 mil veces la gravedad durante 30 minutos. Y luego permita que las soluciones se de pie a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Decantar y guardar el sobrenadante de cada muestra. Lleve a cabo una extracción MPLEx en los residuos ahora extraídos de agua repitiendo estos pasos de extracción. Excepto para sustituir un medio de 20 grados centígrados de cuatro a tres a tres mezclas de cloroformo a metanol por el agua destilada y desgasificación.
Separe cuidadosamente las dos capas de disolvente resultantes, que serán visualmente distinguibles a través de la eliminación de la capa superior mediante un pipeteo cuidadoso. Seque la capa inferior no polar en el secador de congelación. Tan pronto como esté seco, agregue cinco microlitros de cloroformo y 195 microlitros de metanol si se analiza en los próximos días.
Para mejorar la eficiencia de ionización de electrospray para la espectrometría de masas de resonancia de ciclotrón de iones de transformación de cuatro más, abreviado FTICR-MS por inyección directa. Diluir el extracto de cloroformo uno a uno en metanol, y el extracto de agua de dos a uno en metanol. Calibre el espectrómetro FTICR inyectando directamente 100 microlitros de una solución de afinación, que abarca un rango de masa de aproximadamente 100 a 1,300 daltons, en el FTICR-MS.
Inyección directa 100 microlitros del estándar Suwannee River Fulvic Acid a la fuente de ionización electrospray. Acoplado al espectrómetro FTICR a través de una bomba de jeringa ajustada a un caudal de 3,0 microlitros por minuto. Ajuste la tensión de la aguja a 4,4 kilovoltas positivas.
Cola de uno a 100 masa a la relación de carga y el capilar de vidrio a 180 grados centígrados. Inspeccione los espectros resultantes utilizando el software de análisis para confirmar la calidad de los datos. Ahora, introduzca 100 microlitros de cada extracto mediante inyección directa en la fuente de ionización de electrospray, acoplados al espectrómetro FTICR a través de una bomba de jeringa ajustada a un caudal de 3,0 microlitros por minuto.
Establezca los parámetros como antes. Ajuste el tiempo de acumulación de iones para cada muestra o grupo de muestras para tener en cuenta la variación en la concentración de carbono. Recoja 144 escaneos para cada muestra, promedia los escaneos y luego lleve a cabo una calibración interna usando una serie CH2 homóloga.
Seque los extractos utilizando un concentrador y guarde el resto de los extractos para la espectrometría de masas de cromatografía de gases posterior, espectrometría de masas de cromatografía líquida y análisis de espectroscopia de resonancia magnética nuclear. Para prepararse para GC-MS, primero prepare muestras de control en blanco como se detalla en el protocolo de texto. Para proteger los grupos de carbinol añadir 20 microlitros de 30 miligramos por mililitro de clorhidrato de methoxamine en Paradyne a cada una de las muestras, incluyendo los extractos de metanol, los extractos de agua, los espacios en blanco y las muestras de calibración FAME.
Selle los viales con tapas. Vórtice los extractos durante 20 segundos, luego sonicar los extractos durante 60 segundos. Centrifugar los extractos a 37 grados centígrados durante 90 minutos a 100 veces la gravedad.
Añadir 80 microlitros de MSTFA con 1%trimetilclorosilano a cada muestra. Después de vórtices y sonicar los extractos como antes, centrifugar los extractos de nuevo a 37 grados centígrados durante 30 minutos a 100 veces la gravedad. Después de enfriar los extractos a temperatura ambiente, transfiera a los viales de automuestreador GC-MS.
Continúe con el análisis DE GC-MS y el procesamiento de datos como se describe en el protocolo de texto. Para preparar el análisis de RMN en estado líquido, diluya el resto de los extractos de agua en un 10% con un estándar interno de DSS de cinco milimolares. Transfiera la mezcla a un tubo de RMN de vidrio borosilicato de alta calidad y diámetro exterior.
Continúe con el análisis de RMN y el procesamiento de datos como se describe en el protocolo de texto. Para realizar el análisis lipidómico LC-MS, inyecte 10 microlitros de cada extracto en un sistema de cromatografía líquida de ultra rendimiento, acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap utilizando una columna híbrida de superficie cargada por fase invertida. Establezca un degradado de 34 minutos como se indica en el protocolo de texto a una velocidad de flujo de 250 microlitros por minuto.
Utilice modos de ionización negativas y positivas con mayor disociación de colisión de energía y disociación inducida por colisión. Para realizar el análisis proteómico, primero extraiga proteínas de acuerdo con el protocolo MPLEx para el resto de la fase de metanol como se describe en el protocolo de texto. La turba se comparó con la profundidad en el pantano S1 en el spruce y Peatlands Response Under Changing Environments o spRUCE sitio en Minnesota, EE. UU.
3,312 enzimas fueron identificadas en el análisis proteómico. Un análisis de las actividades enzimáticas con profundidad revela que el número de enzimas disminuye bruscamente entre 15 centímetros y 45 centímetros en el pantano de SPRUCE. Para mostrar cómo pueden variar los sitios en las actividades de metabolitos y enzimas, los resultados de SPRUCE se comparan con los de un Permafrost Bog y Fen en el norte de Suecia.
En total, se identificaron 67.040 metabolitos en todas las muestras de turba de SPRUCE a partir de la combinación de análisis FTICR-MS, NMR, GC-MS y LC-MS. Aquí se muestra la fracción relativa de diferentes clases químicas identificadas a través de diversas técnicas en las diferentes profundidades. Mientras que los aminoácidos y azúcares disminuyen con la profundidad, Esto no se observa para los lípidos.
Mediante la validación cruzada de metabolitos identificados en todos los análisis con respecto a la base de datos KEGG, se determinó que los compuestos identificados participan en vías metabólicas comunes como el ciclo del ácido tricarboxílico, la glucólisis y el metabolismo del azúcar. A lo largo de este procedimiento es fundamental ser consciente de las posibles fuentes de contaminación. A partir de la recolección de muestras a través del análisis, las muestras no deben entrar en contacto con plásticos vinculados que pueden afectar negativamente a la ionización.
Muchos de los disolventes utilizados durante el procedimiento de extracción son peligrosos o inflamables. Use siempre un EPP adecuado para evitar el contacto con la piel y los ojos, así como para evitar contaminar las muestras.
