Hola, me llamo Bartolomeo Bosco, y soy estudiante de doctorado en el Laboratorio de La Red Transcripcional del Centro de Biología Integrativa de la Universidad de Trento en Italia. Como usted sabe, la transcripción es un proceso extremadamente complejo que implica la organización espacial y temporal del factor de transcripción y cofactor. La mayoría de ellos, incluido el P53 humano, reconocen elementos específicos que actúan con cis, llamados elementos de respuesta, y la unión en esta secuenciación del ADN es necesaria para la modulación de la transcripción de los genes diana.
En este trabajo, nos gustaría mostrarle el protocolo para estudiar la secuencia P53 específica en funciones de transactivación utilizando la levadura como sistema modelo como proteína en un gen reportero de color o la luciferasa o en la cuantificación del crecimiento celular para resaltar los principales pasos experimentales y la versatilidad de estos enfoques. Protocolo uno, construcción de cepas de levadura reportera que contienen un elemento de respuesta P53 específico aguas arriba de la adenina-2 o el gen de la luciferasa de la luciosa. Para construir una cepa reportera, primero siga los pasos 1.1 a 1.15 para transformar las células de levadura con oligonucleótidos dirigidos a la región promotora deseada.
La transformación se basa en el protocolo estándar basado en acetato de litio. Una vez que los transformantes aparecen en placas 5-FOA, generalmente después de tres días de incubación a 30 grados, los replican en placas YPDA no selectivas y también en placas YPDA que contienen G418, marcando cada placa para facilitar su posterior comparación. Incubar las placas durante la noche a 30 grados.
Al día siguiente, identifique las cepas de reporteros candidatos de colonias que son sensibles al G418 pero que crecieron en placas YPDA. Raya las colonias identificadas en una nueva placa YPDA para obtener aislados de una sola colonia, y dejarlas crecer durante dos días a 30 grados. Compruebe la integración correcta del elemento de respuesta P53 deseado, realizando una reacción PCR con las condiciones mencionadas en el paso 1.20.
Cargue una alícuota del producto PCR en gel de agarosa para comprobar la longitud correcta del amplión antes de la secuenciación de Sanger. Protocolo dos, presentamos un ejemplo de cómo evaluar la capacidad de transactivación de proteínas P53 utilizando el ensayo cualitativo de levadura adenina basada en color 2. Transforme las células de levadura con vectores de expresión P53 siguiendo el mismo protocolo basado en acetato de litio descrito en la sección uno.
Raya colonias transformadoras de levadura única, hasta seis por plato, en una nueva placa selectiva, y dejar que crezcan durante la noche a 30 grados. Al día siguiente, utilizando terciopelos estériles, réplica las rayas en nuevas placas selectivas que permiten la evaluación del fenotipo de color, es decir, placas selectivas que contienen una cantidad limitante de adenina.
Incubar a 30 grados durante tres días. Las mismas rayas se pueden replicar varias veces. Protocolo tres, ahora presentamos un ejemplo de la evaluación de la capacidad de transactivación de proteína P53 utilizando el ensayo cuantitativo de levadura LUC1 basado en luminiscencia.
En primer lugar, transforme las células de levadura con vectores de expresión P53 siguiendo, de nuevo, el protocolo basado en acetato de litio descrito en la sección dos. Parcher los transformantes individuales en nuevas placas selectivas que contengan glucosa como fuente de carbono, y dejarlos crecer a 30 grados durante la noche. Para cada tipo de transformación, haga de cinco a siete parches diferentes.
Después del crecimiento durante la noche, resuspender una pequeña cantidad de células mediante el uso de un palillo de dientes estéril o una punta de pipeta en medio selectivo sintético que contiene rafinosa como fuente de carbono. Estas suspensiones celulares deben tener una densidad óptica a 600 nanómetros alrededor de 0,4 y luego se pueden dividir en múltiples placas de 96 pocillos para la incubación a diferentes temperaturas, tratamientos, o para exponer las células a una cantidad variable de gatasta para activar la expresión P53. Para medir la actividad del reportero de luciérnforo, transfiera de 10 a 20 microlitros de suspensión celular de la placa transparente de 96 pozos a una placa blanca de 384 pozos, y mezcle las células con un volumen igual de tampón de licencia, incubando durante 10, 15 minutos a temperatura ambiente en una coctelera.
Añadir 10, 20 microlitros de sustrato de luciosa de luciérped. Y mida las unidades de luz usando un lector de placas multietiqueta. Mida también la densidad óptica de los cultivos en la placa de 96 pozos.
Protocolo cuatro, ahora presentamos un ejemplo de cómo explotar la inhibición del crecimiento de la levadura inducida por P53. Transforme las células de levadura con vectores de expresión P53, o conviértalas con vectores de expresión para coexpresar P53 y uno de sus cofactores, como MDM2, siguiendo, de nuevo, el protocolo basado en acetato de litio descrito en la sección uno. Cultivo de células transformadoras en medio selectivo a aproximadamente una densidad óptica.
Y diluirlos a 0.05, y añadir una molécula elegida a la concentración adecuada. Incubar las células a 30 grados en un agitador durante 42 horas. Luego, siembra 100 microlitros de cultivo de células de levadura en placas medianas selectivas mínimas.
Incubar durante dos días a 30 grados. La correcta integración RE en lugar del casete ICORE se puede comprobar mediante PCR de colonia, a partir de una pequeña cantidad de células de clones de levadura candidatos y utilizando imprimaciones descritas en la tabla tres para amplificar el locus objetivo. Los productos PCR, una banda de unos 500 nucleótidos, pueden ser comprobados por la secuenciación de Sanger para confirmar la secuencia de la ubicación genómica editada para la presencia de la secuencia de elementos de respuesta P53 correcta.
La cepa reportera está lista para ser utilizada en ensayos funcionales. Para evaluar la capacidad de transactivación de proteína P53, compruebe el color de las colonias de levadura. Por ejemplo, presentamos una comparación entre el tipo salvaje P53 y los mutantes R175H y R282W usando dos reporteros diferentes, P21-5-prime y PUMA, y dos temperaturas diferentes, 30 grados y 37 grados.
Curiosamente, mientras que R175H es un alelo P53 de pérdida de función, colonias rojas en todas las condiciones, R282W muestra sensibilidad a la temperatura con actividad de transactivación residual a 30 grados, resultando en colonias blancas, pero pérdida de actividad a 37 grados, resultando en colonias rojas o rosadas. Un conjunto de datos extendido se presenta en la figura dos P53 de tipo B.Wild en cuatro alelos mutantes que se probaron para la transactivación utilizando 10 cepas diferentes de reportero de elementos de respuesta P53, tres temperaturas y niveles de expresión constitutiva. Los resultados se resumen en un código de color que recuerda el fenotipo de color de la colonia de levadura.
El alelo mutante P53 K139E conserva la actividad parcial y es sensible al frío. Por ejemplo, las colonias son rojas en la cepa reportera GADD45 a 24 y 30 grados, pero son blancas a 37 grados. Aquí, presentamos un ejemplo de resultados obtenidos con este método, comparando la especificidad de la transactivación de la levadura humana y C.elegans P53.
Los resultados en el gráfico de barras se expresan como unidades de luz relativa promedio con error estándar de cuatro réplicas. Se compararon cinco elementos de respuesta P53 diferentes. Se probaron tres niveles diferentes de expresión de proteína P53 variando la concentración de gactosa en el medio.
Los dos ortologos P53 muestran una especificidad de transactivación marcadamente diferente. Esto se ejemplifica con los resultados con los elementos de respuesta ced13 y V1 que comparten la misma secuencia, excepto por la presencia o ausencia de un espaciador de 28 nucleótidos. El P53 humano exhibe una transactivación mucho más alta con el sitio de unión V1, mientras que C.elegans P53 muestra lo contrario.
Los resultados son independientes del nivel de expresión P53 bajo el promotor inducible de gactosa. Mida el crecimiento de la levadura contando el número de colonias obtenidas en las caídas de cultivo de 100 microlitros. Calcular el efecto de reactivación mutante de compuestos considerando el crecimiento de la levadura de tipo salvaje P53 como el efecto máximo posible, establecido en 100%, mientras que el crecimiento de las células que expresan mutante P53 representa el nivel cero de reactivación.
En este ejemplo, Nutlin-3a alivia la inhibición del tipo salvaje P53 causada por la coexpresión de MDM2, mientras que PhiKan083 reactiva parcialmente el mutante Y220C P53. En ambos casos, esto resulta en una reducción dependiente de P53 del crecimiento de la levadura. Las células basales de levadura han demostrado ser útiles para investigar valores, aspectos de las funciones proteicas P53.
El protocolo descrito en este trabajo es particularmente sensible para evaluar el potencial de transactivación de tipo salvaje o mutante asociado al cáncer P53 a variantes de sitios de destino. Además, el enfoque se puede utilizar para identificar moléculas pequeñas que afectan a las funciones P53 y para estudiar la interacción P53 con cofactor. El uso de los reporteros de color, la miniaturización de la luciferasa, así como la prueba de inhibición del crecimiento resultan en ensayos rentables y escalables potencialmente susceptibles al cribado de bibliotecas químicas.
Por último, el sistema descrito en este trabajo se puede adoptar fácilmente con el estudio de otros factores de transcripción específicos de la secuencia.
