El objetivo general de este protocolo es proporcionar una guía detallada para utilizar el minigén E1A2 para evaluar los cambios globales de empalme de ARNm. Esta es una herramienta rápida, económica y simple para evaluar la función de la proteína diana en la regulación alternativa del empalme sin la necesidad de regímenes especiales o condiciones de laboratorio. Comience por el cultivo de células HEK 293 con expresión estable del gen de interés.
Divida las células usando EDTA de tripsina al 0,25%, luego platee 300, 000 células por pocillo en placas de seis pocillos e incube durante 24 horas a 37 grados Centígrados en dióxido de carbono al 5%. Después de 24 horas, compruebe la confluencia y transfecte las células estables HEK 293 solo cuando sea 70 a 80% confluyente. Retire cuidadosamente el medio de cultivo celular con una pipeta, luego agregue dos mililitros de medio DMEM completo sin antibióticos y vuelva a colocar la placa en la incubadora.
Prepare un tubo con el tampón de transfección, luego agregue dos microgramos de ADN pMTE1A, vórtice y agregue dos microlitros de reactivo de transfección. Vórtice de nuevo e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire las placas de la incubadora y agregue cuidadosamente la mezcla de transfección en cuanto a gotas.
Seis horas después de la transfección, agregue tetraciclina a las células estables HEK 293 para la inducción de la expresión de Nek4. 24 horas después de la transfección, verifique la morfología celular y la eficiencia de la transfección utilizando un microscopio fluorescente. Use una pipeta para extraer el medio de cultivo celular y, a continuación, agregue el medio de cultivo celular con los quimioterapéuticos.
Incubar las células durante otras 24 horas. Para recolectar ARN, deseche el medio de cultivo celular y agregue de 0.5 a 1 mililitro de reactivo de extracción de ARN directamente al pozo. Si los pozos son muy confluentes, utilice un mililitro de reactivo de extracción de ARN para mejorar la calidad del ARN.
Homogeneizar las células con una pipeta y transferirlas a un tubo centrífuga de 1,5 mililitros. Proceda inmediatamente a la extracción del ARN, o almacene las muestras en menos 80 grados centígrados. Descongelar las muestras en una campana extractora de humos e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Añadir de 0,1 a 0,2 mililitros de cloroformo y agitar vigorosamente, luego incubar durante tres minutos a temperatura ambiente. Centrífuga durante 15 minutos a 12, 000 veces G y cuatro grados Celsius, luego recoja la fase acuosa superior y transfilíquela a un nuevo tubo centrífuga de 1.5 mililitros. Recoger alrededor del 60% del volumen total, pero no recoger el ADN o la fase orgánica.
Añadir de 0,25 a 0,5 mililitros de isopropanol y agitar la muestra por inversión cuatro veces. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego centrifugar a 12,000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Centígrados y desechar el sobrenadante. Lave el pellet de ARN dos veces con etanol y centrífuga a 7, 500 veces G durante cinco minutos, luego deseche el etanol.
Retire el exceso de etanol invirtiendo el tubo en una toalla de papel, luego deje el tubo abierto dentro de una campana extractora de humos para secar parcialmente el pellet durante cinco a 10 minutos. Vuelva a suspender el pellet de ARN en 15 microlitros de agua tratada con DEPC. Cuantifique el ARN total y verifique la calidad del ARN midiendo la absorbancia a 230, 260 y 280 nanómetros.
Para verificar la calidad total del ARN, ejecute un gel de agarosa al 1% pretratado con un 1,2% de una solución de hipoclorito de sodio al 2,5% durante 30 minutos. Realice la síntesis del cDNA usando uno a dos microgramos de ARN total. Combine el ARN, un microlitro de oligo d-T, un microlitro de DNTP y agua libre de nucleasa a 12 microlitros.
Incubar la reacción en el Thermo Cycler durante cinco minutos a 65 grados Centígrados. Retire las muestras del Thermo Cycler y agregue cuatro microlitros de tampón de la transcriptasa inversa, dos microlitros de TDT y un microlitro del inhibidor de la ribonucleasa. Incubar a 37 grados centígrados durante dos minutos.
Agregue un microlitro de transcriptasa inversa termoestable e incube a 37 grados Centígrados durante 50 minutos. Inactivar la enzima a 70 grados Centígrados durante 15 minutos. Realice la POLIMERIZACIÓN EN CADENA como se describe en el manuscrito del texto, después cargue 20 a 25 microlitros del producto de la polimerización en cadena en un gel de la agarosa del 3% que contiene la mancha del ácido nucleico, y funcione en 100 voltios por aproximadamente una hora.
Fotografíe el gel, evitando cualquier saturación de bandas, y cuantifique las bandas utilizando un software de procesamiento de imágenes. Las bandas en 631, 493, y 156 pares de bases corresponden a las isoformas 13S, 12S y 9S respectivamente. En el menú Archivo del software, abra el archivo de imagen y conviértalo en escala de grises.
Ajuste brillo y contraste y, a continuación, elimine el ruido de valores atípicos si es necesario. Dibuje un rectángulo alrededor del primer carril con la herramienta de selección de rectángulo y selecciónelo a través del comando Analizar, Geles y Seleccionar primer carril, o mediante el método abreviado de teclado. Utilice el ratón para hacer clic y mantener en el centro del rectángulo en el primer carril, y arrástrelo al siguiente carril.
Vaya a Analizar, Geles y Seleccionar el carril siguiente. Repita este paso para todos los carriles restantes. Después de que todos los carriles estén resaltados y numerados, vaya a Analizar, Geles y Trazar carriles para dibujar un diagrama de perfil de cada carril.
Utilice la herramienta de selección de línea recta para dibujar una línea a través de la base de cada pico, correspondiente a cada banda, dejando fuera el ruido de fondo. Después de que todos los picos de cada carril se hayan cerrado, seleccione la herramienta varita y haga clic dentro de cada pico. Las mediciones deben aparecer en la ventana de resultados para cada pico resaltado.
Considere solamente los picos 13S, 12S, y 9S correspondientes a las bandas de los pares de bases 631, 493, y 156. Copie los datos de intensidad de un editor de hojas de cálculo y sume la intensidad de las tres bandas para cada muestra y, a continuación, calcule el porcentaje de cada isoforma en relación con el total. Trazar los porcentajes de cada isoforma, o las diferencias en el porcentaje en relación con las muestras no tratadas.
Un plásmido que contenía el minigene de E1A fue utilizado para observar el efecto sobre empalmar alternativo evaluando la proporción de mRNA de cada isoforma producida. La expresión básica de las variantes de las isoformas de E1A dependió de la línea celular y del tiempo de la expresión de E1A. La línea celular estable HEK 293, o el sitio que contenía la recombinasa HEK 293, mostró una expresión más alta de 13S en comparación con las células de HeLa, pero mostró niveles similares de isoformas 13S y 12S después de 48 horas de expresión de E1A.
Las células expuestas al cisplatin mostraron un cambio en la selección que empalmaba de cinco primeros S-S que favorecía la expresión 12S. Este efecto se observó en HEK 293 expresando de forma estable el vector vacío flag, así como la isoforma uno de Nek4. Los cambios en el empalme alternativo después del tratamiento con paclitaxel fueron muy discretos, pero las direcciones de los cambios fueron opuestas en las células de expresión de Flag y Nek4.
Al realizar este protocolo, es importante utilizar controles de transcriptasa no transfectados y no inversos para evitar la mala interpretación con la expresión endógena de E1A, principalmente cuando se usan células HEK 293. Tras la obtención de resultados positivos, se puede evaluar el empalme alternativo de genes específicos relacionados con la respuesta quimioterapéutica. Cuando se observa algún efecto, este protocolo simple puede dirigir estos estudios para vías más consistentes, donde la proteína desempeña un papel regulador del empalme alternativo en la respuesta a la quimioterapia, por ejemplo.
