Este trabajo fue apoyado por el presupuesto básico del p53lab (BMSI, A*STAR) y la subvención VIP de JCO (A*STAR).

La línea celular HEK293 se utilizó para el protocolo y fue cultivada en el Medio águila modificada de Dulbecco complementado con 10% suero bovino fetal, 2 mM L-glutamina, y 100 penicilina U/mL/ estreptomicina. Las células se cultivaban a 37 °C con un 5% de CO2 en un ambiente humidificado.
1. Evaluación cuantitativa de la interrupción compleja del fei4F a través de eIF4E:eIF4G604-646 ensayo de complementación
<ol><li>Cultivo celular y transfección transitoria de eIF4E:eIF4G604-646 ensayo de complementación<ol>
<li>Utilice células recién descongeladas con menos de 20 pasajes para todos los experimentos. El día 1, determine el número de celda mediante un contador de celdas estándar y cuente las celdas viables totales mediante el método de exclusión azul Trypan13.</li>
		<li>Semillas 6-well placas con 0.9 - 1.2 x 106 de HEK 293 células por pozo en 2 mL de medio de crecimiento estándar. NOTA: Con el fin de lograr la mejor eficiencia de transfección dentro de las líneas celulares indicadas anteriormente, asegúrese de que las células chapadas sean 70-90% confluentes el día después de la siembra.</li>
		<li>En la mañana del día 2, co-transfectar células con SubA-eIF4E y eIF4G604-646-Plásmido SubB utilizando un reactivo de transfección basado en lípidos (ver Tabla de Materiales)como se describe a continuación.<ol>
<li>Diluir 9 μL de solución a base de liposomas en un tubo que contenga 125 μL de medio sérico reducido sin rojo fenol (ver Tabla de Materiales)para cada transfección e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
			<li>Preparar la mezcla maestra de ADN diluyendo 3 μg de cada plásmido en 125 μL de medio sérico reducido para cada tubo de transfección.</li>
			<li>Añadir 12 μL de reactivos potenciadores al tubo de mezcla maestro del ADN, mezclar bien e inmediatamente añadir el ADN: mezcla maestra potenciador a cada tubo de liposomas diluidos en una relación 1:1. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
			<li>Añadir el complejo ADN-lípidos a cada pozo e incubar las células en una incubadora de 37 °C con 5% de CO2 para 24 h.</li>
		</ol>
</li>
		<li>En la mañana del día 3, enjuague cada pozo con 1 ml de PBS.</li>
		<li>Retire el PBS e incuba las células en cada pozo con 0,3 ml de trypsin durante 5 minutos a 37 °C.</li>
		<li>Neutralize la trippsina añadiendo 2 ml del medio sérico reducido sin rojo fenol que contenga un 0% de FCS en cada pozo y transfiera las células transfectadas a un tubo de 15 ml. NOTA: Phenol rojo puede interferir con la actividad luciferasa; por lo tanto, las células deben ser manejadas a partir de este paso hacia adelante en medio sin fenol rojo.</li>
		<li>Gire hacia abajo las células durante 5 minutos a 290 x g y aspire el medio. Resuspend las células en 2 ml del medio sérico reducido sin fenol rojo que contiene 0% FCS. Cuente como se describe en el paso 1.1.</li>
		<li>Células HEK 293 transfectadas por semillas en 96 placas opacas de pozo a una densidad de 30.000 células por pozo en 90 μL de medio sin fenol rojo que contenga un 0% de FCS. Con el fin de obtener 3 réplicas técnicas dentro del mismo experimento para 3 compuestos diferentes, sembrar 60 pozos de las placas con células excluyendo los pozos en los bordes.</li>
		<li>Inmediatamente después de sembrar las células transfectadas, agregue 10 μL de solución compuesta DMSO al 10% (ver paso 1.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de compuestos<ol>
<li>Prepare soluciones de stock compuesto de 1 mM disolviendo el compuesto de interés en 100% DMSO (v/v). Para tener 3 réplicas para cada valoración compuesta, utilice 8 μL de la solución de stock compuesto de 1 mM. NOTA: El volumen de compuesto de stock de 1 mM utilizado es más de lo que se necesita. Esto se hace para tener en cuenta los errores de pipeteo si los hay.</li>
		<li>Realice una dilución serie de 2 veces la solución compuesta de stock con 4 μL de la caldo de 1 mM en 4 μL de 100% DMSO para cada punto de valoración. NOTA: Para una valoración compuesta completa, realice 9 diluciones en serie del stock inicial en 100% DMSO. Si es necesario probar varios compuestos, utilice una placa de pozo 96 y una pipeta multicanal para facilitar este paso y las diluciones posteriores.</li>
		<li>Añadir 36 μL de agua estéril de grado HPLC para cada punto de la dilución serie de 2 veces para preparar un 40 μL de soluciones de trabajo de 10x en un 10% de DMSO (v/v) (es decir. 100 μM a 0,39 μM 10% serie de stock DMSO dará lugar a una solución final de 10 μM a 0,039 μM, en 1% DMSO cuando se agrega a las células). En cuanto al control del tratamiento, también prepare una solución de stock dmso del 10% en agua estéril de grado HPLC.</li>
		<li>Añadir 10 μL de soluciones de trabajo de 10x a las células de la placa opaca de 96 pozos para producir la concentración final prevista con una concentración dmso residual del 1% (v/v) en un volumen total de 100 μL e incubar durante 3 h a 37 °C con un 5% de CO atmosférico v/v2.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo de complementación y viabilidad luciferasa<ol>
<li>Después de 3 h de drogado, comience a preparar el reactivo de sustrato luciferasa combinando 1 volumen de sustrato con 19 volúmenes del reactivo de dilución (consulte las instrucciones del fabricante). NOTA: El ensayo luciferasa se realiza utilizando un kit disponible comercialmente (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Utilice una pipeta multicanal para añadir inmediatamente 25 μL de reactivo de sustrato.</li>
		<li>Agitar la placa a 350 rpm durante 50 minutos en un agitador orbital a temperatura ambiente.</li>
		<li>Evalúe la luminiscencia utilizando un lector de placas. Para ello, ajuste el lector de espejos sobre la luminiscencia y el filtro de emisión en 455. Utilice una altura de medición de 6,5 mm con un tiempo de medición de 1 s.</li>
		<li>Con el fin de asesar la viabilidad de la célula, añadir 33 μL de reactivo de ensayo de viabilidad y luego volver a medir la luminiscencia de nuevo después de 15 min a temperatura ambiente, utilizando el lector de placas.</li>
		<li>Evalúe la luminiscencia con el lector de placas estableciendo el lector de espejos en Luminiscencia y el filtro de emisión en 600 nm. Utilice una altura de medición de 6,5 mm con un tiempo de medición de 1 s. NOTA: La viabilidad se evalúa midiendo el nivel intracelular de ATP en la lisis celular según las instrucciones del fabricante. Multiplexación es posible en este caso ya que el ensayo de viabilidad utiliza una luciferasa diferente con una longitud de onda de emisión diferente.</li>
		<li>Utilice los datos para determinar los valores IC50 de cada compuesto ajustando los datos a una ecuación de curva de ajuste de 4 parámetros: Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B)))) + D Los valores numéricos D y A deben restringirse en el proceso de ajuste de curva: D = valor luminiscente en el eje Y para un asimptoto de curva mínimo o un nivel teórico mínimo de respuesta esperado del ensayo de complementación eIF4E:4G. A = valor luminiscente en el eje Y para asímptoto de curva máxima o respuesta máxima de nivel teórico esperada del ensayo de complementación eIF4E:4G. NOTA: El valor de la respuesta mínima se deriva del tratamiento de control 1% DMSO (v/v) y el valor de la respuesta máxima se deriva de la respuesta máxima de un inhibidor de mTOR de alta afinidad que se ha estancado sin ningún efecto sobre la viabilidad celular.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Correlación eIF4E:eIF4G604-646 inhibición del ensayo con interrupción del complejo eIF4F en las células
<ol><li>Para confirmar que la señal que está midiendo el ensayo corresponde a la interrupción física de la interacción eIF4E-eIF4G por el compuesto, células de semillas como se describe en el paso 1.1.</li>
	<li>Al día siguiente, sustituir el medio por 1 ml de medio sérico reducido que no contenga fenol rojo e incubar durante 4 h por el compuesto de interés. Asegurar una concentración residual de DMSO del 1% (v/v) en un volumen total de 1 mL. NOTA: Con el fin de permitir fácilmente una correlación con el resultado, utilice concentraciones compuestas al principio, punto medio y punto final de la curva de valoración del ensayo de complemento medido.</li>
	<li>Lilas y realizóm7GTP tirar hacia abajo para aislar los complejos eIF4F y eIF4E:4EBP1. Los procedimientos detallados sobre cómo realizar el m7GTP pull down experiment se pueden encontrar en otro lugar14.</li>
	<li>Detecte los nivelesdeproteína eIF4G, eIF4E y 4EBP1 vinculados a m7 GTP mediante el análisis de manchas occidentales y, a continuación, correlacione con la interrupción del complejo eIF4F con la inhibición de la señal de ensayo de complemento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método descrito en este artículo utiliza un ensayo de complementación basado en luciferasa para monitorear cuantitativamente el montaje complejo eIF4F a través de la medición directa de la interacción eIF4G-eIF4E en células vivas. Hemos proporcionado detalles para el uso del sistema de complementación eIF4E-eIF4G y también hemos demostrado que el sistema es extremadamente preciso en la medición de la disociación mediada por 4EBP1 inducida por fármacos de la interacción eIF4E-eIF4G16</sup...

El control de la expresión génica desempeña un papel fundamental en la correcta ejecución de programas celulares como la proliferación del crecimiento y la diferenciación. Se puede ejercer un mecanismo de control reglamentario ya sea a nivel de transcripción genética o a nivel de traducción de ARNm. En la última década, se ha hecho cada vez más evidente que el control traslacional mediante la modulación del proceso de iniciación en lugar de los pasos posteriores de alargamiento y terminación puede regular finamente la síntesis de subconjuntos específicos de proteínas que desempeñan una amplia gama de funciones biológicas.
El aumento de la traducción de los MRNAs implicados en la supervivencia, las respuestas anti-autofágicas y anti-apoptóticas se ha implicado en varios tipos de cáncer y también se ha relacionado causalmente con la activación aberrante o con la expresión excesiva de los factores de iniciación a la traducción1.
El complejo eIF4F es un regulador maestro de la iniciación de la traducción. Al enlazar la estructura de la tapa en el extremo de 5' de losRNAs, eIF4F está impulsando la contratación inicial de ARNm-ribosoma y, a su vez, aumentando la eficiencia de traducción de ARNm de ARNM eucariota débilmente traducida2. Se ha notificado una traducción mediada por eIF4F de los mRNAs relacionados con el cáncer para muchos modelos de cáncer que albergan la activación aberrante de las vías RAS/MAPK o AKT/TOR, lo que sugiere que las células cancerosas upregulan eIF4F para impulsar su propia actividad pro-neoplástica. La interrupción de este bucle avance mediante la inhibición de la formación compleja eIF4F es por lo tanto una estrategia terapéutica muy prometedora3,4.
El complejo eIF4F consiste en (i) eIF4E, la subunidad de unión a la tapa de eIF4F que interactúa con la estructura de la tapa que se encuentra en el 5' UTR de ARNm, (ii) eIF4A, la helicasa de ARN y (iii) eIF4G, la proteína andamio que interactúa tanto con eIF4A como con eIF4E y que finalmente recluta el 40S ribosomal subu5nit. La asociación eIF4G con eIF4E es el paso limitante de velocidad para el montaje de complejos funcionales eIF4F y está regulada negativamente por las proteínas de unión eIF4E (4EBPs, miembros 1, 2 y 3))6. Al competir con el enlace eIF4G a eIF4E a través de una interfaz que consiste en secuencias de enlace eIF4E canónicas y no canónicas7,8,9 (región que abarca aa 604-646 en eIF4E humano), 4EBP reduce el grupo de eIF4E involucrado activamente en la traducción y prevención de la formación compleja eIF4F. La interacción entre estas interacciones proteína-proteína está regulada principalmente por el objetivo de los mamíferos de la fosforilación mediada por la rapamicina (mTOR) de 4EBP. Tras los estímulos mitogénicos, mTOR fosforila directamente a los miembros de la familia proteica 4E-BP, disminuyendo su asociación con eIF4E y, por lo tanto, promoviendo la interacción eIF4E-eIF4G y la formación de complejos funcionales eIF4F10.
A pesar del gran esfuerzo en el desarrollo de compuestos dirigidos a la integridad compleja eIF4F, la falta de ensayos que miden la interrupción directa de la interacción eIF4E-eIF4G en las células vivas ha limitado la búsqueda de compuestos de golpe activo celular. Hemos aplicado un ensayo luciferasa basado en un análogo de coelenterazina (por ejemplo, ensayo de complementación basado en Nanoluc) para monitorear en tiempo real el estado de integridad de eIF4F a través de la interacción eIF4E-eIF4G. El sistema de proteínas de complementación luciferasa consiste en un fragmento de proteína de 18 kDa (SubA) y 11 fragmentos de péptido de aminoácidos (SubB) optimizados para una mínima auto-asociación y estabilidad11. Una vez expresado como un producto de fusión con el eIF4E de longitud completa humana y el dominio de interacción eIF4E del eiF4G1 humano (aa 604-646), las dos proteínas que interactúan acercarán el fragmento SubA y SubB entre sí e inducirán la formación de la luciferasa activa que, en presencia de un sustrato permeable celular, eventualmente generará una señal luminiscente brillante(Figura 1). Hemos informado en otros lugares de la construcción y validación del sistema de complementación eIF4E:eIF4G604-646 16.
Aquí, describimos cómo el sistema de complementación eIF4E:eIF4G604-646 (disponible bajo petición) se puede aplicar para medir con precisión la interrupción eIF4E-eIF4G mediada por 4EBP1 en las células vivas. Además, demostramos su utilidad midiendo los efectos de varios inhibidores de mTOR que actualmente están bajo ensayos clínicos como posibles fármacos terapéuticos contra el cáncer12. Debido a que los efectos fuera del objetivo a menudo enmascaran la actividad específica de drogas, también describimos cómo la versatilidad de la medición del sistema eIF4E:eIF4G604-646 se puede ampliar con mediciones ortogonales de viabilidad celular para tenerlas en cuenta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

Se ha demostrado que la formación del complejo eIF4F es el nodo descendente clave para la convergencia de vías de señalización que a menudo se someten a activación oncogénica en humanos. eIF4F es un complejo de unión a la tapa que participa en la fase de reclutamiento del ARNm-ribosoma de iniciación de traducción. En muchos modelos celulares y preclínicos de cáncer, la desregulación del eIF4F conduce a una mayor traducción de subconjuntos específicos de ARNm que están involucrados en la proliferación y supervivencia del cáncer. eIF4F es un complejo hetero-trimérico construido a partir de la subunidad de unión a la tapa eIF4E, el eIF4A helicaso y el subunit de andamios eIF4G. Fundamental para el montaje de complejos activos eIF4F es la interacción proteína-proteína entre las proteínas eIF4E y eIF4G. En este artículo, describimos un protocolo para medir el ensamblado eIF4F que supervisa el estado de la interacción eIF4E-eIF4G en celdas vivas. El ensayo de interacción proteína-proteína basado en células eIF4e:4G también permite evaluar con precisión y fiabilidad los cambios inducidos por fármacos en la integridad compleja del fei4F. Vislumbramos que este método puede aplicarse para verificar la actividad de compuestos disponibles comercialmente o para un mayor cribado de nuevos compuestos o modalidades que interrumpan eficientemente la formación del complejo eIF4F.

Con el fin de validar la sensibilidad del sistema de complementación eIF4E:eIF4G604-646, se evaluó la inhibición mediada de 4EBP1 del conjunto complejo eIF4F mediante inhibidores de mTOR. Al inhibir la fosforilación dependiente de la quinasa mTORC1 de la familia de proteínas 4EBP, la inhibición del mTOR mejora la asociación 4EBP1 a eIF4E y, por lo tanto, el desmontaje eIF4F15. Se probaron dos clases de inhibidor mecanicísticamente diferente de la...

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Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Aquí, presentamos un protocolo para medir la interacción eIF4E-eIF4G en células vivas que permitiría al usuario evaluar la perturbación inducida por fármacos de dinámicas complejas eIF4F en formatos de cribado.

Monitorización del conjunto eIF4F midiendo la interacción eIF4E-eIF4G en células vivas

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

monitoring-eif4f-assembly-measuring-eif4e-eif4g-interaction-live

Research

JoVE Journal

Cancer Research

3.0K vistas.  A*STAR (Agency for Science, Technology and Research). Aquí, presentamos un protocolo para medir la interacción eIF4E-eIF4G en células vivas que permitiría al usuario evaluar la perturbación inducida por fármacos de dinámicas complejas eIF4F en formatos de cribado.

Video: Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients have achieved complete remission (CR). Approximately half of the adult patients who entered CR will relapse within 12 months due to the outgrowth of residual AML cells in the bone marrow. The quantitation of these remaining leukemia cells, known as minimal or measurable residual disease (MRD), can be a robust biomarker for the prediction of these relapses. Moreover, retrospective analysis of several studies has shown that the presence of MRD in the bone marrow of AML patients correlates with poor survival. Not only is the total leukemic population, reflected by cells harboring a leukemia associated immune-phenotype (LAIP), associated with clinical outcome, but so is the immature low frequency subpopulation of leukemia stem cells (LSC), both of which can be monitored through flow cytometry MRD or MRD-like approaches. The availability of sensitive assays that enable detection of residual leukemia (stem) cells on the basis of disease-specific or disease-associated features (abnormal molecular markers or aberrant immunophenotypes) have drastically improved MRD assessment in AML. However, given the inherent heterogeneity and complexity of AML as a disease, methods for sampling bone marrow and performing MRD and LSC analysis should be harmonized when possible. In this manuscript we describe a detailed methodology for adequate bone marrow aspirate sampling, transport, sample processing for optimal multi-color flow cytometry assessment, and gating strategies to assess MRD and LSC to aid in therapeutic decision making for AML patients.

Detection of minimal or measurable residual disease (MRD) is an important prognostic biomarker for refining risk assessment and predicting relapse in acute myeloid leukemia (AML). These comprehensive guidelines and recommendations with best practices for consistent and accurate identification and detection of MRD, may aid in making effective AML treatment decisions.

General protocolo muestra y médula de proceso para medir enfermedad Residual medible y células leucémicas en la leucemia mieloide aguda

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological information is also necessary. The protocol of immunocytochemical staining on paraffin-embedded cell blocks, presented herein, is an excellent alternative to immunofluorescent staining on non-paraffin-embedded fixed cells. In this protocol, a paraffin cell block from HeLa cells was prepared using the thromboplastin-plasma method, and immunocytochemistry was performed for the evaluation of two proliferation markers, CKAP2 and Ki-67. The nuclei and cytoplasmic morphology of the HeLa cells were well preserved in the cell-block slides. At the same time, the CKAP2 and Ki-67 staining patterns in the immunocytochemistry were quite similar to those in immunohistochemical staining in paraffin cancer tissues. With modified cell-culture conditions, including pre-incubation of HeLa cells under serum-free conditions, the effect could be evaluated while preserving architectural information. In conclusion, immunocytochemistry on paraffin-embedded cell blocks is an excellent alternative to immunofluorescent staining.

Currently, immunofluorescent staining on fixed cells is the method of choice for determination of protein expression levels when morphological information is also necessary. This protocol presented herein provides for an alternative method of immunocytochemistry on paraffin-embedded cell blocks.

Determinación del nivel de expresión de la proteína en células cultivadas por Immunocytochemistry en bloques de parafina-encajado de la célula

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

Un ensayo de la matanza de esferoide por las células de T automóvil

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

Caracterización semiautomática PD-L1 y enumeración de células tumorales circulantes de pacientes con cáncer de pulmón celular no pequeño por inmunofluorescencia

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

Ensayo In Vitro para estudiar la interacción tumor-macrofago

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

Evaluación In Vitro de la Transformación Oncogénica en Células Epiteliales Mamarias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

Un modelo esferoide tridimensional para investigar la interacción tumor-estroma en el carcinoma hepatocelular

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural microenvironment and stromal cell interaction, cannot be entirely replicated with in vitro assays; thus, animal models are critical for investigating and understanding the effects of therapeutic intervention. However, most brain tumor xenografting methods do not produce brain metastases consistently in terms of the time frame and tumor burden. Brain metastasis models generated by intracardiac injection of cancer cells can result in unintended extracranial tumor burden and lead to non-brain metastatic morbidity and mortality. Although intracranial injection of cancer cells can limit extracranial tumor formation, it has several caveats, such as the injected cells frequently form a singular tumor mass at the injection site, high leptomeningeal involvement, and damage to brain vasculature during needle penetration. This protocol describes a mouse model of brain metastasis generated by internal carotid artery injection. This method produces intracranial tumors consistently without the involvement of other organs, enabling the evaluation of therapeutic agents for brain metastasis.

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Most brain metastasis mouse models are complicated by systemic metastases confounding analysis of mortality and therapeutic intervention outcomes. Presented here is a protocol for internal carotid injection of cancer cells that produces consistent intracranial tumors with minimal systemic tumors.

Modelado de metástasis cerebrales mediante inyección de células cancerosas en la arteria carótida interna

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex vivo drug screenings. However, current adenosine triphosphate (ATP)-based drug screening assays do not capture the complexity of a drug response (cytostatic or cytotoxic) and intratumor heterogeneity that has been shown to be retained in PDTOs due to a bulk readout. Live-cell imaging is a powerful tool to overcome this issue and visualize drug responses more in-depth. However, image analysis software is often not adapted to the three-dimensionality of PDTOs, requires fluorescent viability dyes, or is not compatible with a 384-well microplate format. This paper describes a semi-automated methodology to seed, treat, and image PDTOs in a high-throughput, 384-well format using conventional, widefield, live-cell imaging systems. In addition, we developed viability marker-free image analysis software to quantify growth rate-based drug response metrics that improve reproducibility and correct growth rate variations between different PDTO lines. Using the normalized drug response metric, which scores drug response based on the growth rate normalized to a positive and negative control condition, and a fluorescent cell death dye, cytotoxic and cytostatic drug responses can be easily distinguished, profoundly improving the classification of responders and non-responders. In addition, drug-response heterogeneity can by quantified from single-organoid drug response analysis to identify potential, resistant clones. Ultimately, this method aims to improve the prediction of clinical therapy response by capturing a multiparametric drug response signature, which includes kinetic growth arrest and cell death quantification.

This protocol describes a semi-automated method for medium- to high-throughput organoid drug screenings and microscope-agnostic, automated image analysis software to quantify and visualize multiparametric, single-organoid drug responses to capture intratumor heterogeneity.

Detección multiparamétrica de fármacos organoides tumorales mediante imágenes de células vivas de campo amplio para análisis a granel y de un solo organoide

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D tumoroids. Since patient derived tumor organoids can retain the characteristics of the original tumor, these reliable preclinical models enable cancer drug screening and the study of drug resistance mechanisms. However, CRC related death in patients is mostly associated with the presence of metastatic disease. It is therefore essential to evaluate the efficacy of anti-cancer therapies in relevant in vivo models that truly recapitulate the key molecular features of human cancer metastasis. We have established an orthotopic model based on the injection of CRC patient-derived cancer cells directly into the cecum wall of mice. These tumor cells develop primary tumors in the cecum that metastasize to the liver and lungs, which is frequently observed in patients with advanced CRC. This CRC mouse model can be used to evaluate drug responses monitored by microcomputed tomography (&#181;CT), a clinically relevant small-scale imaging method that can easily identify primary tumors or metastases in patients. Here, we describe the surgical procedure and the required methodology to implant patient-derived cancer cells in the cecum wall of immunodeficient mice.

This protocol describes the orthotopic implantation of patient-derived cancer cells in the cecum wall of immunodeficient mice. The model recapitulates advanced colorectal cancer metastatic disease and allows for the evaluation of new therapeutic drugs in a clinically relevant scenario of lung and liver metastases.

La implantación ortotópica de células cancerosas derivadas de pacientes en ratones recapitula el cáncer colorrectal avanzado

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...