La preparación estándar de muestras dificulta el logro de una buena señal a ruido durante los experimentos de difracción de rayos X de microcristales. Este protocolo tiene como objetivo reducir las fuentes de cristales formados de fondo de manera controlada. El uso de la robótica de punzonado y las rejillas cryoTEM proporcionan una plataforma robusta para manipular los microcristales repetidamente, reduciendo el volumen de líquido circundante y proporcionando una rápida vitrificación de la muestra.
La destreza necesaria para manejar las rejillas es similar a la necesaria para la cosecha tradicional de cristales. Otro factor importante es la determinación de los parámetros iniciales de borrado utilizando la solución de cristalización, que es clave para reducir el uso de la muestra. Para comenzar, configure y enfríe el congelador automático de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Justo antes de su uso, descargue las rejillas crioTEM durante 25 segundos con una corriente de 15 miliamperios y una presión de 0,39 milibares, luego mantenga las rejillas de descarga de resplandor en una placa de Petri cubierta. Establezca la humedad relativa de la cámara de muestra en 90% y el tiempo de borrado en cinco segundos. Asegúrese de que el congelador de inmersión esté configurado para sumergir automáticamente la muestra después de que se complete la eliminación.
Abra el sello del pozo de cristalización y el depósito. Agregue rápidamente de dos a cinco microlitros de la solución del depósito en la gota de cristal para mantener el volumen de la gota. Transfiera 10 microlitros de la solución del depósito a un tubo de 0,5 mililitros para su uso posterior y vuelva a secar el pozo para evitar que la gota de cristalización se seque.
Use las pórceps de congelación por inmersión para elegir una sola rejilla de descarga de resplandor y cargue la rejilla en el instrumento con el lado de carbono mirando hacia afuera del brazo secante. Gire las rozas que sujetan la rejilla de modo que el lado de carbono se enfrente al brazo secante. Utilice una pipeta de 2,5 microlitros para aplicar dos microlitros de solución de depósito en el lado no soportante de la rejilla cryoTEM.
Gire la rejilla con el lado de carbono mirando hacia otro lado del brazo secante y aplique cuidadosamente el líquido del depósito al lado de soporte de la película de carbono de la rejilla. Inicie el proceso de borrado y observe el líquido extraído de la superficie de carbono hasta que la onda de estallido a través de la superficie de la rejilla sea visible. Si la onda de estallido no es visible, aumente el tiempo de borrado de uno a dos segundos antes de que el brazo de borrado se retraiga de la rejilla.
Coloque la placa de cristalización bajo el microscopio de luz y coloque el objetivo bien dentro del campo de visión. Coloque una rejilla de descarga de resplandor fresco en el congelador de inmersión y aplique el líquido del depósito al lado no soportante de la rejilla como se demostró anteriormente. Gire la rejilla con el lado de soporte de la película de carbono frente al puerto de muestra del congelador de inmersión.
Despegue el sello temporal de la placa de cristalización y use el juego de pipetas en dos microlitros para aspirar suavemente la gota de cristalización repetidamente. Transfiera dos microlitros de la suspensión de microcristales aspirados al congelador de inmersión y aplique toda la muestra al lado de carbono de la rejilla crioTEM. Inicie el blotting y observe la ola de estallido, luego inicie inmediatamente la congelación de la inmersión.
Transfiera rápidamente la rejilla del etano líquido a la caja de rejilla sumergida en nitrógeno líquido. Después de secar y sumergir la congelación de la rejilla, retraiga la rejilla sumergida del etano líquido reiniciando el congelador de inmersión. Retire las pórceps que sujetan la rejilla del congelador de inmersión y coloque la rejilla debajo del microscopio de luz.
Ajuste el enfoque fino y evalúe la densidad de los cristales a través de la rejilla. Después de cargar la rejilla crioTEM en el SEM, alinee la muestra y encienda el haz de electrones. Inicialmente, evalúe toda la cuadrícula a un aumento de 45X y registre la imagen, luego aumente la ampliación para una inspección más cercana de los cuadrados de cuadrícula individuales hasta que los cristales individuales se observen claramente.
Muévase por la cuadrícula y capture las imágenes fijas, asegurándose de que las rejillas sean planas y que la película de soporte de carbono esté en gran parte intacta. Asegúrese de que haya numerosos cristales individuales con un halo estrecho de líquido vitrificado que rodea el cristal y que los orificios sean visibles en la película de soporte de carbono. Mientras observa y captura las imágenes de la rejilla, asegúrese de que las grandes regiones de líquido vitrificado estén ausentes, que el hielo hexagonal o el hielo superficial no estén dispersos por la rejilla, y que los cristales no se superpongan y se distribuyan uniformemente a través de la película de soporte.
En un dewar de espuma grande, enfríe el número requerido de soportes de muestra VMXm cargados en el cartucho de muestra. Agregue nitrógeno líquido por encima de la posición de la muestra en el cargador de muestras. Transfiera rápidamente la caja de rejilla que contiene rejillas cargadas con microcristales al hueco de la caja de rejilla en el cargador de muestras y desenrosque ligeramente la tapa para mantener la tapa suelta y giratoria.
Levante la rejilla de la caja de rejilla y gire la rejilla para dejar la rejilla plana en el soporte de la muestra. Coloque rápidamente la herramienta circlip preenfriada sobre la rejilla en la abertura de la cuadrícula y presione el botón para instalar el circlip. Agregue nitrógeno líquido aproximadamente 1,5 centímetros por encima del soporte de la muestra.
Utilice las pórceps de muestra VMXm para levantar cuidadosamente el soporte de muestra cargado y volver a colocarlo en el cartucho de muestra. Reemplace la tapa del cartucho, asegurándose de que el pasador en la parte superior del cartucho se engancha con el orificio de la tapa. Las micrografías electrónicas de barrido de microcristales preparadas en rejillas cryoTEM mostraron una dispersión de fondo mínima.
La rejilla estaba libre de exceso de líquido y se observó un estrecho halo de líquido rodeando los cristales. Los cristales poliédricos se observaron individualmente, así como en grupos. Los cristales de insulina ligeramente más grandes también mostraron cierta aglomeración junto con cristales aislados.
También se montaron con éxito microcristales muy grandes en rejillas crioTEM. Los agujeros en la película de soporte de carbono eran claramente visibles, lo que indica una fuerte mancha. Muchas muestras requirieron una mayor optimización debido a la variación en el tiempo de borrado y la concentración de los microcristales.
Las rejillas sobrecargadas con cristales reducen la eficiencia de borrado y se registraron múltiples redes en una sola imagen de difracción. El corto tiempo de borrado para soluciones de cristalización altamente viscosas puede resultar en una muestra demasiado húmeda. Para una solución de cristalización de menor viscosidad, un corto tiempo de borrado resulta en el robo de microcristales en un lado de las rejillas.
La preparación óptima de la muestra permite explotar todas las capacidades de VMXm para recopilar datos de difracción de rayos X de alta calidad a la resolución más alta posible con una alta relación señal-ruido. Determinar el borrado inicial de una solución de cristalización es clave para usar una muestra mínima. Si la muestra es muy limitada, omita la evaluación de densidad.
En última instancia, es mejor tener una muestra diluida. Estas muestras ahora están listas para experimentos de difracción de rayos X en vmXm Beamline, difracción de electrones microcristales o fresado de haz de iones enfocado antes de micro ED.
