Este protocolo demuestra la cristalización de proteínas en un dispositivo similar a un chip en la recolección de datos de difracción de rayos X. Este dispositivo se llama cristal sobre cristal porque los cristales de proteína crecen en un solo cristal de cuarzo. Tras el crecimiento exitoso de cristales de proteínas en tales dispositivos, se recogen miles de imágenes de difracción de cada dispositivo a temperatura ambiente sin siquiera tocar los cristales de proteína.
La difracción de rayos X a temperatura ambiente es muy esencial para estudiar la función de las proteínas que involucran muchos estados conformacionales. Estos cambios informativos de proteínas o acciones de proteínas pueden congelarse, por lo que no son detectables en criocristalografía. Estos dispositivos se pueden utilizar para estudiar los procesos de señalización inducidos por la luz y los cambios redox.
Solo un puñado de dispositivos proporciona conjuntos de datos completos y redundantes. Para comenzar el preensamblaje del dispositivo, etiquete el anillo exterior para la identificación de la muestra. Incluya el nombre del proyecto, el número de dispositivo, la condición de cristalización y la fecha que desee.
Luego coloque el anillo etiquetado boca abajo sobre una superficie limpia y coloque una oblea de cuarzo dentro del anillo exterior. A continuación, vierta una pequeña cantidad de aceite de inmersión de microscopio en una placa de Petri y sumerja una cuña en el aceite asegurándose de que ambos lados de la cuña estén bien recubiertos. Elimine cualquier exceso de aceite frotando la cuña sobre una superficie limpia.
Luego coloque la cuña aceitada encima de la primera oblea de cuarzo. Mezclar la solución proteica y el tampón de cristalización en la primera oblea de cuarzo con una pipeta. Trate de evitar las burbujas de aire al mezclar.
El volumen total de la solución de cristalización no debe exceder la capacidad máxima de la cámara de cristalización determinada por el tamaño y el grosor de la cuña. Coloque la segunda oblea de cuarzo sobre la solución mezclada. La solución se extenderá espontáneamente.
Luego golpee ligeramente la segunda oblea de cuarzo en el borde para ayudar a difundir el aceite mientras expulsa el aire. Asegure el dispositivo atornillando un anillo de retención en el anillo exterior. Si es necesario, utilice una herramienta de apriete.
Evite apretar demasiado, ya que puede causar que las delicadas obleas de cuarzo se deformen o agrieten. Guarde los dispositivos ensamblados en una caja a temperatura ambiente o dentro de una incubadora con temperatura controlada. Después de unas horas o días, coloque el dispositivo de cristalización bajo un microscopio y controle el crecimiento del cristal.
Si es necesario, optimice las condiciones de cristalización como se describe en el manuscrito. Para la calibración, instale un cristal YAG delgado en el soporte del chip, luego instale el tope del haz. A continuación, abra el software Insitux y ejecute el programa indicado para tomar imágenes de fluorescencia de rayos X del haz directo donde el dispositivo es un nombre seleccionado por el usuario para el dispositivo de cristalización y el dispositivo.
Param es el nombre de archivo que contiene parámetros de control específicos del dispositivo. Luego encuentre la posición precisa del haz de rayos X directo ejecutando el programa de ajuste de perfil de haz donde la imagen de grabación es el nombre de archivo de la imagen de fluorescencia de rayos X. Para el escaneo óptico, coloque un dispositivo de cristalización en el soporte del chip y asegúrelo con un tornillo de pulgar.
Luego monte el soporte del chip en la etapa de traslación del difractómetro a través de un mecanismo cinemático. Dependiendo de la sensibilidad a la luz de la muestra de proteína y el propósito del experimento, instale una fuente de luz blanca o infrarroja para tomar micrografías de la ventana óptica del dispositivo. Una vez que la configuración esté lista, ejecute el programa de escaneo ingresando el comando indicado para escanear en movimiento en la línea del haz.
A continuación, ejecute el programa de mosaico en un equipo de usuario donde x es el valor inicial de la columna e y es el valor inicial para desplazamientos no autorizados de micrografías. El programa une todas las micrografías en un montaje de uno a tres micrómetros de resolución de píxeles. Después de coser las micrografías, ingrese el comando indicado para ejecutar el programa de búsqueda de cristales.
Este programa realiza el reconocimiento de cristales y la planificación de disparos y los parámetros clave en este programa permiten la selección específica de cristales y la planificación de objetivos. Retire la fuente de luz y coloque el tope del haz. A continuación, ejecute el programa de recopilación de datos para la difracción en serie.
El comando sugerido desencadena la recopilación de datos visitando las tomas planificadas en una secuencia preprogramada. Cada cristal objetivo se transloca a la posición del haz. En cada parada, la exposición a rayos X se toma con o sin iluminación láser en un retraso de tiempo programado.
En el estudio, se compararon las condiciones de cristalización entre la difusión de vapor y un lote en chip. Aquí se demuestran cuatro estudios de casos de cristalización en chip y conjuntos de datos representativos recopilados directamente de dispositivos de cuarzo. Los experimentos de cristalografía dinámica revelaron cambios inducidos por la luz en la proteína fotorreceptora de color rojo lejano al comparar datos de 4.352 cristales en la oscuridad y 8.287 cristales después de la iluminación de la luz.
El conjunto de datos oscuros de la difracción de Laue en serie in situ dio como resultado densidades de electrones mejor resueltas, lo que permite la construcción segura del modelo de un cromóforo bilin en una conformación de signo Z. Los mapas de diferencias inducidas por la luz han revelado movimientos concertados en la lámina beta central, lo que sugiere la importancia del apilamiento pi-pi entre los anillos pirrólicos del cromóforo y varios residuos aromáticos. Esta plataforma se llama Insitux.
La ventaja única de esta plataforma es que uno no tiene que hacer ninguna manipulación de cristal una vez que se realiza la cristalización. Es necesario recopilar muchos conjuntos de datos en condiciones cambiantes para capturar los movimientos de las proteínas. Y esto es posible con Insitux porque permite la recopilación de datos a gran escala de miles de cristales de proteínas a temperatura ambiente.
Con esta nueva capacidad, incluida la cristalografía, los sistemas sensibles a la luz se pueden activar dentro del dispositivo y el sistema inerte de luz se puede estudiar si el dispositivo de cristal sobre cristal se convierte en flujos de salida.
