Desarrollamos un ensayo de alto rendimiento para medir trampas extracelulares de neutrófilos, o NT. Las NT son estructuras de ADN inmunogénicas que son expuestas por neutrófilos. Los NG pueden atrapar y matar microorganismos y, por lo tanto, son un importante mecanismo antiges infeccioso, pero también desempeñan un papel patógeno en las enfermedades autoinmunes.
Con esta técnica, los TIL se cuantifican mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia tridimensional, lo que resulta en un método altamente sensible y de alto rendimiento para estudiar la formación y degradación de NET. Esta técnica nos permite cuantificar la formación NET de pacientes con enfermedades autoinmunes. La formación de EX vivo NET de pacientes con vasculitis asociada a ANCA o lupus eritemtosis sistémica podría ser monitoreada con este ensayo.
Además, las terapias potenciales dirigidas a la formación de NET podrían probarse con este ensayo in vitro. El aislamiento de neutrófilos podría ser una lucha para las personas que nunca antes habían realizado esta técnica. Para comenzar este procedimiento, obtenga 20 mililitros de sangre periférica de un donante sano en dos tubos codificados con EDTA de 10 mililitros.
Transfiera 10 mililitros de sangre en un tubo estéril de 50 mililitros y PBS a un volumen total final de 32,5 mililitros. Usando una pipeta de 10 mililitros y un controlador de pipetas, tome hasta 14 mililitros de gradiente de densidad. Coloque la pipeta en la parte inferior del tubo de 50 mililitros.
A continuación, saque el controlador de pipeta de la pipeta, lo que permite que el gradiente de densidad fluya por gravedad hasta que el máximo sea alcanzado por efecto capilar. Coloque un pulgar en la parte superior de la pipeta para evitar que el gradiente de densidad restante se escape y, a continuación, retire la pipeta del tubo. Centrifugar el tubo a 912 g a temperatura ambiente durante 20 minutos sin aceleración ni freno.
Retire cuidadosamente el anillo blanco que contiene las células mononucleares de sangre periférica primero, seguido del plasma diluido por PBS. Por último, elimine la capa de degradado de densidad tanto como sea posible. A continuación, recupere una botella de agua destilada estéril fría y un matraz de 10 veces PBS concentrado de un refrigerador.
Trabajando rápidamente, agregue 36 mililitros del agua directamente encima del pellet y mezcle cuidadosamente una vez. Después de 20 segundos contados desde el principio, agregue cuatro mililitros de 10 veces PBS para hacer una solución isotónica. Y de nuevo, mezcle una vez con cuidado.
Centrifugar el tubo a 739 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante, asegurándose de ser extremadamente cuidadoso ya que el pellet no es sólido, y repita rápidamente el proceso de adición del agua destilada estéril en frío y PBS concentrado como se describió anteriormente. Centrifugar a 328 veces g y cuatro grados celsius durante cinco minutos.
Retire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de PBS. Cuenta los neutrófilos y mantenlos en hielo. En primer lugar, hacer una suspensión de neutrófilos que contenga aproximadamente 10 a 20 millones de neutrófilos en dos mililitros de PBS en un tubo de 15 mililitros.
En un tubo diferente de 15 mililitros, mezcle dos mililitros PBS con cuatro microlitros de dos micromolares rojos fluorescentes. Agregue suavemente la solución del eslabón de celda fluorescente roja a la suspensión de neutrófilos y mezcle cuidadosamente. Envuelva el tubo en papel de aluminio para proteger la mezcla de la luz, e incubar durante exactamente 25 minutos a 37 grados Celsius para etiquetar a los neutrófilos con el eslador de celdas fluorescentes rojas.
Inactivar el etiquetado añadiendo RPMI 1640 medio que contiene 10%calor inactivado FCS a temperatura ambiente a un volumen final de 15 mililitros y mezclar una vez cuidadosamente. Si después de esto se ha formado un pellet, rea suspenda cuidadosamente la mezcla. Centrifugar el tubo a 328 g a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Antes de retirar el sobrenadante, asegúrese de que se ha formado un pellet. Después de esto, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de rpmI 1640 libre de rojo que contiene 2%FCS a temperatura ambiente. Entonces, cuenta los neutrófilos.
Haga una suspensión celular a una densidad de 420.000 células por mililitro en un medio RPMI 1640 libre de fenol que contiene 2%FCS. Agregue 37.500 neutrófilos en 90 microlitros a cada pozo de una placa negra de 96 pozos y fondo plano. A continuación, añadir 10 microlitros del estímulo elegido en triplicado para alcanzar una concentración del 10% en cada pozo.
Incluya siempre un control negativo en triplicado. Incubar en la oscuridad a 37 grados centígrados durante el tiempo deseado, que van desde 30 minutos a dos, cuatro o seis horas. A continuación, preparar el volumen de tinte de ADN impermeable necesario para añadir 25 microlitros de tinte de ADN impermeable de cinco micromolares para alcanzar una concentración final de un micromolar en cada pozo.
15 minutos antes del final del tiempo de incubación, añadir 25 microlitros de cinco micromolares de colorante de ADN impermeable de cinco micromolares a cada pocólimo. Continúe la incubación durante los últimos 15 minutos a 37 grados centígrados en la oscuridad. Después de esto, retire el sobrenadante con mucho cuidado y guárdelo si es necesario.
Añadir 100 microlitros de 4%paraformaldehído. Mantenga la placa en la oscuridad, e inmediatamente proceder a la siguiente sección. Después de configurar los ajustes, seleccione Serie Z.
Seleccione 10 como número de pasos. Seleccione tres micrómetros como tamaño de paso. Cargue la placa en el microscopio confocal de inmunofluorescencia.
Haga clic en la pestaña Ejecutar. Rellene el nombre y la descripción de la placa y elija la ubicación de almacenamiento. Seleccione los pozos que deben adquirirse.
Elija el tiempo de exposición para Texas Red y FITC. A continuación, haga clic en Adquirir placa e inicie la adquisición, que tardará aproximadamente una hora por plato. Después de esto, seleccione Macro de análisis.
A continuación, seleccione w1 y elija el valor de umbral. A continuación, seleccione el valor de píxel deseado. Y, por último, en una segunda ventana de Image J, seleccione w2 y elija el valor de umbral con el valor de píxel deseado.
Seleccione un destino para el archivo de hoja de cálculo, ejecute el análisis y guarde el archivo de registro después. Aquí se presenta un ensayo ampliamente aplicable altamente sensible para la cuantificación semiautomática de la formación de trampas extracelulares de neutrófilos para la evaluación de la inducción ex vivo de trampas extracelulares de neutrófilos en diferentes estímulos. La formación neta se cuantifica de manera tridimensional cuantificando el ADN extracelular talado sobre 10 pilas Z con distancia de tres micrómetros que comienza en el plano focal en cada pozo.
Mediante la medición del área acumulativa, aumenta la sensibilidad del ensayo. El área total de neutrófilos manchados con imagen se cuantifica sólo en el plano focal en cada pozo, lo que se correlaciona significativamente con el recuento total de neutrófilos en cada pozo con un coeficiente de correlación de Pearson de 0,99. El resultado representativo de la cuantificación de la formación neta en neutrófilos se expresa como área de ADN extracelular teñida acumulativa sobre 10 pilas Z por neutrófilo de imagen.
A continuación, se toman instantáneas del ensayo de cuantificación neta. Aquí se muestran imágenes representativas de neutrófilos no estimulados y de NPT en neutrófilos estimulados por AAV con los neutrófilos con etiqueta fluorescente en rojo y el ADN extracelular teñido en verde. Los neutrófilos deben manipularse con cuidado, y el etiquetado PKH debe realizarse exactamente de acuerdo con el protocolo.
Este ensayo se puede utilizar para estudiar la morfología, la cinética y la composición de los NT. Esta técnica es otro método que ofrece la posibilidad de estudiar NFT en salud y enfermedad. Trypan blue, PKH y PFA deben manipularse con guantes y no deben inhalarse directamente.
