Este proyecto fue apoyado en parte por una beca de los Institutos Nacionales de Salud NIAID (por AJB y LGA, R01 AI076246). La colección mutante de Salmonella fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones (por MM, U01 A152237-05, R01, R01 AI07397-01 AI039557-11 y R01 AI075093-01), en parte por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones (por HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Damos las gracias a Steffen Prowollik de réplica en placa y confirmando los mutantes de la colección.

1. murino macrófagos RAW264.7 Cell Culture <ol><li> Crecer bajo número de pasos células de macrófagos murinos, RAW264.7 (el número ATCC ®, TIB-71) en un matraz de cultivo celular ventilado tapa T-75 de filtro en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) , 0,5% de NaHCO3, y el 1% 100x Los aminoácidos no esenciales (AANE) a 37 ° C, en un incubador de CO2 al 5%. </li><li> Una vez que las células alcanzan una confluencia del 60-80% en el matraz, utilizar un rascador de células para cosechar las células, y contar las células en un hemocitómetro y calcular la concentración de células. </li><li> Resuspender las células y diluir la concentración de células en 2,5 x 10 5 / ml en medio de cultivo celular DMEM fresco. Utilice pipetas multicanal a la placa 200 l de medio de cultivo celular DMEM que contiene 5 x 10 4 células en cada pocillo de placas de 96 pocillos de cultivo celular. </li><li> Placa cuatro pozos de cada cepa de Salmonella. Establecer tres placas separadas por un conjuntode ensayo de invasión de las células fagocíticas, y marcarlos con &quot;asociación&quot;, &quot;invasión&quot; y &quot;réplica&quot;, respectivamente. </li><li> Coloque las placas en el incubador de CO2 al 5% a 37 ° C en ON para permitir que las células de los macrófagos para insertarse en el fondo de los pozos. </li></ol> 2 Preparación de Salmonella de tipo salvaje y los mutantes <ol><li> El mismo día de la preparación de las células RAW264.7 macrófagos, recoger colonias individuales de tipo salvaje (WT) de Salmonella enterica serotipo Typhimurium 14028s, mutantes DinvA, DphoP mutantes y las cepas mutantes de prueba deseados, y la cultura en Luria-Bertani ( LB) caldo suplementado con antibióticos, según proceda. Use cada conjunto de los ensayos de invasión de las células fagocíticas para probar hasta 10 cepas mutantes (DinvA mutante y DphoP mutante son defectuosos en la invasión y la replicación intracelular, respectivamente). </li><li> Cultivar las bacterias durante 14 horas a 37 ° C con sHaking a 220 rpm en 5 ml cada uno de caldo LB taparon sin apretar en 14 ml de polipropileno en un tubo de fondo redondo. Caldo LB contiene antibióticos apropiados, en nuestro caso, la mayoría de las cepas mutantes son resistentes a la kanamicina, 50 mg / ml </li><li> Al día siguiente, cada subcultura del sobre cultivos de cepas de Salmonella en llano 5 ml de caldo LB en una proporción de 01:50 para una 4 horas más con agitación a 220 rpm. </li><li> Leer OD 600 valores de cada cultivo bacteriano en un espectrofotómetro, y cada lectura debe oscilar 0,6-1,2 para optimizar Salmonella isla de patogenicidad-1 tipo III sistema de secreción (SPI-1 TTSS) la expresión génica para la invasión. </li><li> Usa la fórmula de 1 OD 600 = 7,5 x 10 8 UFC / ml para estimar la concentración bacteriana, a continuación, las bacterias se diluye hasta una concentración de 5 x 10 6 UFC / ml en medio de cultivo celular DMEM fresco. </li></ol> 3. ensayo de invasión en el 96-así placa de cultivo <ol><li> Remover tres cel 96 pocillosl placas de cultivo de la incubadora de CO 2 y lavarla una vez con 200 l de tampón PBS 1x. </li><li> Después del lavado y la eliminación completa de PBS, añadir 200 l de bacterias en medio DMEM (ver arriba) en cada pocillo. Esto da lugar a 1 x 10 6 células de Salmonella en cada multiplicidad bien y de infección (MOI) de 20: 1. </li><li> Centrifugar las placas a 1000 xg en un vehículo cerrado durante 10 minutos, luego vuelva a colocar las placas (tiempo cero) en un 37 ° C, 5% de CO2 durante 30 min. Para cada cepa, configurar al menos cuatro pocillos por duplicado. </li><li> Después de 30 min, quitar placas de la incubadora y se lava tres veces con 200 l de 1x PBS para eliminar las bacterias no asociados. </li><li> Tras el lavado, guardar la placa marcada con &quot;asociación&quot; para continuar el tratamiento. Añadir 200 l de medio DMEM que contiene 100 mg / ml de gentamicina a cada pocillo de las placas marcadas con &quot;invasión&quot; y &quot;replicación&quot; para to matar la Salmonella extracelular. Devolver las placas a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante una hora adicional. </li><li> Guardar un pocillo de cada cepa infectada para la grabación de recuento de células de macrófagos, tratar el resto de los pozos en la placa de &quot;asociación&quot; con 200 l de 1x PBS que contenía 1% de Triton X-100 durante 10 min. La solución de Tritón lisar células de macrófagos y la liberación Salmonella asociado. </li><li> Harvest Salmonella de cada pocillo y los situará en 1,5 ml tubos Eppendorf. Realice tres 10 diluciones seriadas con 900μl 1x PBS en las muestras recolectadas de cada pocillo, vórtice se realiza entre cada dilución. </li><li> Placa de la tercera dilución, 10 -3, en cualquiera de LB (WT) o LB Kan (mutantes) placas. Etiquetar las placas con nombre apropiado cepa de Salmonella, el número de dilución, punto en el tiempo y la fecha. </li><li> Después de la tercera vórtex tubo de dilución, dispensar la muestra 10 l en la superficie del agar y repita fnuestros tiempos para un total de 5 gotas. Asegúrese de espacio de los cinco 10 l cae uniformemente sobre las placas plato de Petri 7. </li><li> Después de que las gotas mojen el agar, gire las placas e incubar durante la noche a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Tratar pozos guardados para el recuento de los macrófagos con 150 mu l 1 x PBS que contiene 0,25% de tripsina-EDTA durante 10 min. </li><li> Después de tripsinización, lugar macrófagos en 1,5 ml tubos Eppendorf y los tratan con 50 l de FBS para neutralizar la solución de tripsina / EDTA, se tiñen las células con 0,4% tripán azul y puntúan a través de el uso de hemocitómetro. </li><li> Cuando ha transcurrido la incubación de una hora, retirar la &quot;invasión&quot; y placas &quot;replicación&quot; de la incubadora de CO 2, y lavar cada pocillo como &quot;Paso 3.4&quot;. </li><li> Guarde la placa de &quot;invasión&quot; para su posterior tratamiento como &quot;Paso 3.6 a 3.12&quot;. </li><li> Añadir 200 l de medio DMEM que contiene 10 mg / ml de gentamicina ala placa de &quot;replicación&quot; para mantener el espacio libre de Salmonella en el medio extracelular. Devuelva la placa a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora para un 22.5 h adicionales. </li><li> Al día siguiente, retire la placa de &quot;réplica&quot; de 37 ° C, 5% de CO2, y lavar cada pocillo como &quot;Step 3.4&quot; y tratarlos como &quot;Step 03.06 a 03.12&quot;. </li><li> Por último, eliminar las placas de agar después de la incubación durante la noche en 37 ° C incubadora y anotar el número de colonias bacterianas. </li><li> Una buena distribución de colonias debe estar entre 10 y 100 colonias, cada punto contiene aproximadamente 2 a 20 colonias, que sería difícil de marcar si había más de 20 colonias en un solo lugar. Si el recuento es demasiado baja o demasiado alta, replate la muestra con 10 veces diluciones mayores o menores según sea necesario. </li></ol> Análisis 4. Datos <ol><li> Calcular las (unidades de formación de colonias por ml) CFU de cada placa base en el forrovolumen y el factor de dilución. </li><li> Determinar el número de Salmonella por los macrófagos a través del recuento de células de macrófagos registrado de cada cepa. </li><li> Calcular las medias geométricas de CFU por macrófagos a partir de al menos tres experimentos independientes para la asociación celular, invasión o la replicación, respectivamente, y normalizar aún más a la WT para el valor relativo. </li><li> Analizar los datos de la asociación, la invasión y la replicación de la prueba t de Student, respectivamente, mediante la comparación de cada cepa a WT, y determinar la significación estadística por el p-valor. </li></ol>

<ol>
	<li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interplay+with+host+cells.">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria+and+antibiotics.">Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics.</a> The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance.">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).</li><li>Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+invasion+and+adherence+directed+by+the+enterotoxigenic+Escherichia+coli+tib+locus+is+associated+with+a+104-kilodalton+outer+membrane+protein.">Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein.</a> Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).</li><li>Behlau, I., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PhoP-repressed+gene+promotes+Salmonella+typhimurium+invasion+of+epithelial+cells.">A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells.</a> J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).</li><li>Hueck, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+secreted+invasion+determinants+are+homologous+to+Shigella+Ipa+proteins.">Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins.</a> Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).</li><li>Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+epithelial+cells+with+Salmonella+enterica.">Infection of epithelial cells with Salmonella enterica.</a> Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).</li><li>Foster, J. W., Spector, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Salmonella+survive+against+the+odds.">How Salmonella survive against the odds.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).</li><li>Edwards, A. M., Massey, R. 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J., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+1-independent+induction+of+apoptosis+in+infected+macrophages+by+Salmonella+enterica+serotype+typhimurium.">Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium.</a> Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).</li><li>Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+molecular+characterization+of+Salmonella+typhimurium+infection+in+neonatal+calves.">Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves.</a> Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).</li><li>Lawhon, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SPI-1+secreted+effectors+in+acute+bovine+response+to+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+a+systems+biology+analysis+approach.">Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach.</a> PLoS One. 6, e26869 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Salmonella+SPI1+effector+SopB+stimulates+nitric+oxide+production+long+after+invasion.">The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.</a> Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).</li></ol>

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El ensayo de protección de gentamicina se utiliza ampliamente para estudiar la invasión y la replicación de patógenos bacterianos intracelulares dentro de la célula huésped, y es especialmente una herramienta biológica importante para el estudio de los patógenos, como Salmonella, cuya invasión es el paso requisito previo para el establecimiento de la infección 1. El ensayo estándar de protección de gentamicina en la comunidad de investigación de Salmonella se implementa en 24 po...

No tifoidea Salmonella son causas importantes de enfermedades entéricas en todos los vertebrados. La salmonelosis en los seres humanos es una de las principales enfermedades transmitidas por los alimentos bacterianas 1. Caracterización de los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones de Salmonella con sus huéspedes animales se logra principalmente a través del estudio de Salmonella enterica serotipo Typhimurium (STM) en cultivo de tejidos y modelos animales de infección. Obtener ideas en las interacciones huésped-STM nos ayudará a entender cómo Salmonella sobrevivir y crecer dentro de las células huésped. El primer reto en el estudio de estas interacciones es identificar el mayor número de factores que participan como sea posible, tanto huésped y el patógeno, pero estos esfuerzos estén obstruidas en gran medida por las dificultades significativas de tratar con dos sistemas biológicos complejos independientes de forma simultánea, es decir, de acogida y Salmonella, en condiciones fisiológicas. Además, la gran RepertOire de Salmonella y genes de acogida factores que intervienen en las interacciones huésped potencialmente codifican requieren plataforma biológica de alto rendimiento para hacer frente a este desafío. A modificada, ensayo estandarizado fenotipo asociación Salmonella, invasión y replicación en macrófagos con capacidad de alto rendimiento fue desarrollado para examinar un gran conjunto de genes que participan en las interacciones probables de Salmonella -host. El ensayo de protección de gentamicina fue desarrollado en 1973 2, pero fue el primero en describir minuciosamente por Elsinghorst en 1994 3,4. Ahora se ha convertido en una herramienta estándar para el estudio de muchos patógenos bacterianos intracelulares ex vivo, incluyendo Salmonella 5,6. Bacterias internalizadas evitar ser asesinados por algunos antibióticos, tales como gentamicina, que no pueden penetrar las células eucariotas 3. Al tomar ventaja de este fenómeno, el ensayo de protección de gentamicina mide la supervivencia y crecimiento de ba intracelularpatógenos cterial. Tres eventos durante la infección, es decir, la asociación con las células eucariotas, la invasión y la replicación, pueden ser evaluadas para los patógenos bacterianos intracelulares basados ​​en el intervalo de tiempo entre la infección, el tratamiento de gentamicina, e incubación adicional (Figura 1). Líneas celulares eucariotas proporcionan un entorno fisiológico que es menos complejo que los modelos animales relevantes para los estudios de interacción huésped-patógeno. El ensayo de protección de gentamicina es una plataforma adecuada para estudiar las interacciones STM-anfitrión, pero el ensayo estándar en una placa de cultivo de 24 pocillos tiene baja capacidad de rendimiento. Análisis computacional de los conjuntos de datos in vivo identificó 149 productos génicos Salmonella que se predicen para interactuar con aproximadamente 300 productos de los genes de acogida (datos no publicados). El ensayo de protección estándar Gentamicina no tiene la capacidad de fenotipo este número de mutantes de manera eficiente. En addition, el ensayo de protección de gentamicina puede detectar teóricamente la invasión de incluso una sola bacteria. Debido a esta sensibilidad inherente, los datos en bruto son susceptibles a las variaciones técnicas cuando se repite en diferentes momentos. Los controles internos y la presentación de los datos en relación después de la normalización son esenciales para la interpretación significativa de los resultados. Dadas estas consideraciones, un ensayo de protección de gentamicina normalizado modificado fue desarrollado para mejorar la capacidad de prueba y aumentar la precisión. El siguiente protocolo es detallada e ilustrada para llevar a cabo el ensayo de protección de gentamicina modificado utilizando 96 pocillos y placas de cultivo de la línea celular de macrófagos murinos RAW264.7. En comparación con el protocolo estándar de 24 pocillos placas de cultivo, el protocolo modificado tiene las siguientes ventajas: 1) El uso de 96 pozos placas de cultivo permite hasta 10 diferentes cepas mutantes que fenotipados incluidos los controles positivos y negativos internos con suficiente poder estadístico;2) La varianza de los resultados se reduce significativamente, porque las cepas mutantes se ensayaron de la misma placa de cultivo y, al mismo tiempo; 3) El uso de pipetas multicanal aumenta el rendimiento al tiempo que reduce la fatiga del operador. Por último, en comparación con 24 y placas de cultivo, las preocupaciones de menos células huésped por pocillo en 96-así placa de cultivo se abordaron a través de la optimización del protocolo y la normalización. En resumen, el modificado, ensayo estandarizado para Salmonella in vitro fenotipo u otra asociación bacteriana, la invasión y la replicación en las células fagocíticas aumenta la precisión y logra la capacidad de alto rendimiento al tiempo que reduce la fatiga del operador.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:173px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11965</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:173px;">HyClone</td>
			<td style="width:173px;">SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">T-75 cell culture flask vented filter cap</td>
			<td style="width:173px;">Nest Biotechnology</td>
			<td style="width:173px;">708003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">100X Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">353086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">96-well cell culture plate</td>
			<td style="width:173px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:173px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:173px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:173px;">3002-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">PBS pH7.4 (1x)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Kanamycin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">K0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Gentamicin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages

Especies de Salmonella son patógenos zoonóticos y principales causas de las enfermedades transmitidas por los alimentos en los seres humanos y el ganado 1. La comprensión de los mecanismos que subyacen a las interacciones Salmonella -host son importantes para dilucidar la patogénesis molecular de la infección por Salmonella. El ensayo de protección de Gentamicina fenotipo asociación Salmonella, la invasión y la replicación en las células fagocíticas fue adaptado para permitir la selección de alto rendimiento para definir las funciones de los mutantes de deleción de Salmonella enterica serotipo Typhimurium en las interacciones huésped utilizando RAW 264,7 macrófagos murinos. Bajo este protocolo, la varianza en las mediciones se reduce significativamente en comparación con el protocolo estándar, porque de tipo salvaje y cepas mutantes múltiples pueden ser probados en la misma placa de cultivo y, al mismo tiempo. El uso de pipetas multicanal aumenta el rendimiento y mejora la precisión. Además, las preocupaciones relacionadas con el uso de menos hose trataron células st por pocillo en 96-así placa de cultivo. En este caso, el protocolo de la vitro Salmonella ensayo modificado en la invasión utilizando células fagocíticas se empleó con éxito al fenotipo 38 mutantes de deleción Salmonella individuales para la asociación, la invasión y la replicación intracelular. Se presentan los fenotipos in vitro, algunos de los cuales fueron posteriormente confirmó que en fenotipos in vivo en un modelo animal. Por lo tanto, la modificación, ensayo estandarizado fenotipo Salmonella asociación, la invasión y replicación en macrófagos con capacidad de alto rendimiento podría ser utilizado más ampliamente para estudiar las interacciones huésped-bacteriana.

Ver resultados representativos (Figura 2) después de que los datos que se muestran en base al ensayo de invasión celular fagocítica modificado. Los datos incluyen cinco cepas diferentes, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutante A y B. mutante Δ Inva, conocido por ser defectuoso para la invasión, y ΔphoP conocidos por ser defectuoso para la replicación 8, se utilizaron como controles positivos para evaluar la validez experimental . En efecto, en el ensayo de invasión modi...

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High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Un ensayo de alto rendimiento in vitro de Salmonella fenotipo u otra asociación bacteriana, invasión, y la replicación en las células fagocíticas con capacidad de alto rendimiento se ha desarrollado. Se empleó el método de evaluar las cepas mutantes de Salmonella gen knockout por sus implicaciones en la interacción huésped-patógeno.

Ensayo de alto rendimiento para Fenotipo<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Asociación Typhimurium, Invasión y replicación en macrófagos

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

high-throughput-assay-to-phenotype-salmonella-enterica-typhimurium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

12.5K vistas.  Texas A&M University.  Un ensayo de alto rendimiento in vitro de Salmonella fenotipo u otra asociación bacteriana, invasión, y la replicación en las células fagocíticas con capacidad de alto rendimiento se ha desarrollado. Se empleó el método de evaluar las cepas mutantes de Salmonella gen knockout por sus implicaciones en la interacción huésped-patógeno. 

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An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus. However, there are two species, six subspecies, and over 2,500 different Salmonella serovars, and not all are equal in their significance to public health. For example, finding S. enterica subspecies IIIa Arizona on a table egg layer farm is insignificant compared to the isolation of S. enterica subspecies I serovar Enteritidis, the leading cause of salmonellosis linked to the consumption of table eggs. Serovars are identified based on antigenic differences in lipopolysaccharide (LPS)(O antigen) and flagellin (H1 and H2 antigens). These antigenic differences are the outward appearance of the diversity of genes and gene alleles associated with this phenotype.
We have developed an allelotyping, multiplex PCR that keys on genetic differences between four major S. enterica subspecies I serovars found in poultry and associated with significant human disease in the US. The PCR primer pairs were targeted to key genes or sequences unique to a specific Salmonella serovar and designed to produce an amplicon with size specific for that gene or allele. Salmonella serovar is assigned to an isolate based on the combination of PCR test results for specific LPS and flagellin gene alleles. The multiplex PCRs described in this article are specific for the detection of S. enterica subspecies I serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium.
Here we demonstrate how to use the multiplex PCRs to identify serovar for a Salmonella isolate.

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

We describe a multiplex PCR for the rapid detection of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium. Specific Salmonella serovars can be identified by targeting a multiplex PCR to genes and sequences unique to the O-antigen biosynthesis cluster and flagellin of a given serovar. Serovar is assigned then to a Salmonella isolate based on the appearance of specific, size amplicons (PCR product) corresponding to the target allele.

Una PCR para la identificación de Allelotyping Salmonella enterica Serotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg, y Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

Investigación

Inmunología e Infección

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

Un protocolo para infectar<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Con<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Cuantificación de Citosólica vs. Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; En macrófagos primarios por permeabilización diferencial

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

De Alto Rendimiento de genes de marcado en las<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

Un análisis de alto rendimiento para evaluar y cuantificar la formación de neutrófilos trampa extracelular

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...