El campo de investigación de Shigella carece actualmente de ensayos bien definidos para examinar el papel funcional de los anticuerpos generados por la inmunización o la infección. Este ensayo representa un método bien definido para calificar estas respuestas inmunitarias y medir la actividad bactericida de los anticuerpos específicos de Shigella. La principal ventaja de este ensayo es que permite un análisis de alto rendimiento de varias muestras.
Las técnicas utilizadas en este protocolo reducen en gran medida el tiempo práctico y el tiempo de ensayo general para medir la matanza bacteriana directa de anticuerpos y muestras de suero. Para comenzar, incubar las muestras en un baño de agua caliente a 56 grados centígrados durante 30 minutos para calentar y activar las muestras de prueba. Obtenga una placa de ensayo y 20 microlitros de búfer de ensayo en las columnas de una a doce de las filas A a G.Agregue 20 microlitros de búfer de ensayo a las columnas uno y dos de la fila H.Load 30 microlitros de cada muestra de prueba y duplique a la fila H de la placa de ensayo.
Para comenzar a realizar triples diluciones seriales de las muestras de prueba, utilice una pipeta multicanal para extraer 10 microlitros de los pozos 3H a 12H. Transfiera las muestras a los pozos correspondientes en la fila G y la pipeta hacia arriba y hacia abajo de 8 a 10 veces para mezclar bien la muestra. A continuación, retire 10 microlitros de estos pozos.
Transfiera a los pozos correspondientes en la fila F y pipetee hacia arriba y hacia abajo de 8 a 10 veces para mezclar. Continuar este proceso de dilución en serie a través de la fila A.Después de mezclar los pozos en la fila A, retire y deseche 10 microlitros de los pozos 3A a 12A para que el volumen final en todos los pozos sea de 20 microlitros. Recuperar un vial de stock bacteriano objetivo congelado y descongelarlo a temperatura ambiente.
Luego, diluir las bacterias en 20 mililitros de tampón de ensayo. de acuerdo con el factor de dilución óptimo predeterminado. Con una pipeta multicanal, añada 10 microlitros de bacterias diluidas a cada pozo de la placa de ensayo.
Recupera un vial de Baby Rabbit Compliment congelado y un vial de BRC activado por calor congelado. Utilice agua corriente fría para descongelar los viales a temperatura ambiente. A continuación, mezcle 100 microlitros de BRC activados por calor con 400 microlitros de tampón de ensayo.
Agregue 50 microlitros de esta solución BRC activada por calor del 20 por ciento a todos los pozos de la columna uno. Mezclar un mililitro de BRC nativo con cuatro mililitros de tampón de ensayo. Añadir 50 microlitros de esta mezcla del 20 por ciento a todos los pozos en las columnas de dos a doce.
Coloque la placa una coctelera de placa durante 10 a 15 segundos para mezclar suavemente la placa de ensayo. Incubar la placa de ensayo en una incubadora microbiológica durante dos horas. Mientras tanto, retire las tapas de las dos placas de agar LB y coloque las placas boca arriba en un armario de seguridad biológica durante 40 a 60 minutos para secar.
Una vez completada la incubación, transfiera la placa de ensayo al hielo húmedo e incubar durante 10 a 20 minutos para detener la reacción. Con una pipeta de doce canales, mezcle los pozos en la fila H y la placa puntual 10 microlitros de la mezcla de reacción en la parte inferior de una placa LBA. Incline inmediatamente la placa y deje que las manchas funcionen durante aproximadamente 1,5 a 2 centímetros.
Repita este procedimiento para las filas G, F y E, el que las detecte por encima de la fila anterior. Incubar las placas LBA a temperatura ambiente hasta que la solución se absorba en las placas LBA. Luego, ponga las tapas en las placas y transfieralas al revés a una incubadora microbiológica para incubar durante la noche.
Al día siguiente, agregue 25 mililitros de agar superpuesto a 55 grados centígrados, que contienen 100 microgramos por mililitro TTC y 0.1 por ciento de azida sódica a cada placa de LBA. Incubar a 37 grados centígrados durante dos horas para permitir que las bacterias sobrevivientes desarrollen un color rojo. A continuación, utilice una cámara digital para fotografiar las placas.
Transfiera las imágenes a un ordenador y utilice el software Integrated Colony Enumerating del NIST para analizar las imágenes tal como se describe en el protocolo de texto. Las placas representativas de LBA demuestran que el desarrollo del color ha tenido lugar después de la incubación durante la noche y la adición de la superposición, con todas las colonias sobrevivientes siendo visibles en rojo. La matanza bacteriana se observa claramente para todas las muestras analizadas en las tres primeras diluciones.
Se observa una disminución en la matanza bacteriana a medida que las muestras se diluyen más arriba de la placa y el suero está menos concentrado. Los recuentos de microcolony se realizan utilizando el software NIST. A continuación, se calcula el recuento medio de UFC para cada dilución de cada muestra, al igual que el valor de matanza del 50 por ciento.
Este valor de matanza del 50 por ciento se aplica a las UFC promedios para cada dilución sérica para determinar los valores necesarios para calcular el SBA KI. Este protocolo se basa en un revestimiento bacteriano uniforme y uniforme en LB Auger. Una buena técnica de chapado e inclinación permite el crecimiento de microcolonieos discretos y un recuento preciso de colonias. Esta técnica utiliza Shigella virulenta viva y requiere una técnica aséptica adecuada y EPI para garantizar que las bacterias se manejen de forma segura de acuerdo con los procedimientos de BSL 2.
