La recuperación de fluorescencia existente después de la fotoblancada, los protocolos FRAP, son incompletos o demasiado complejos. El protocolo presentado en este video es significativo en que es completo, práctico y directo. La principal ventaja de esta técnica FRAP es que permite cuantificar la movilidad proteica dentro y entre compartimentos subcelulares en células vivas.
FraP se está estudiando tanto para fines terapéuticos como diagnósticos. Uno de estos usos es cuantificar la difusión dentro de los sistemas de administración de fármacos en diferentes tejidos in vivo. Esta información puede utilizarse para optimizar una estructura y composición de fármacos.
La técnica de microscopía FRAP ha proporcionado información sobre una amplia gama de campos en los que la comprensión del fenómeno de la difusión es de interés. Estos incluyen biología celular y molecular, biología del desarrollo, neurociencia, ciencia de materiales, biomateriales avanzados y descubrimiento de fármacos. Aunque el protocolo descrito es para su uso con células de mamíferos, los conceptos se pueden aplicar a otros sistemas, como células vegetales, células de levadura y bacterias.
Un individuo que nunca ha realizado esta técnica puede tener problemas para determinar los parámetros óptimos de adquisición de imágenes, crear una región de adquisición de interés que sea adecuada para su experimento y calcular la fracción móvil y el medio tiempo de recuperación. Al intentar este procedimiento por primera vez, asegúrese de realizar varios experimentos piloto para optimizar el protocolo en el contexto de los objetivos del experimento. Demostrando el procedimiento estarán Maleen Cabe, un técnico de mi laboratorio, y David Rademacher, el gerente de la instalación de imágenes.
Para empezar, prepare una placa de macrófagos RAW264.7 trans infectados YFP-p62 y trátelos con Lipopolisacárido como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, enjuague las células tratadas con el tampón de Tyrode un poco frío. Luego, agregue dos mililitros de tampón de Tyrode suplementado con Nocodazol a la placa, y permita que las placas se incuban a cuatro grados centígrados durante 15 a 20 minutos antes de la toma de imágenes y el análisis frap.
Deje que las placas se incuban a cuatro grados centígrados durante 15 a 20 minutos antes del diagnóstico y análisis frap de FRAP. En la configuración de imágenes, seleccione la línea de 514 nanómetros del láser Argon/2, ya que el marcador de fluorescencia tiene una excitación máxima a 512 nanómetros y una emisión máxima a 527 nanómetros. A continuación, en la ventana Control láser, haga clic en Argon/2, 458, 477, 488, 514 y, a continuación, haga clic en el botón En espera.
Después de esperar unos tres minutos para que el láser se caliente, haga clic en el botón Activado. A continuación, ajuste la potencia láser del láser al 100% y pulse Intro. A continuación, establezca la transmisión de la línea láser en 5% En el microscopio, gire al objetivo de aceite de aumento de 63x de aumento de Plan-Apochromat 63x 1.40.
Vea el espécimen a través del ocular del microscopio y coloque una estructura inducida similar a la agregosa en el centro del campo de visión. A continuación, en el software de adquisición, establezca el tamaño del fotograma en 512 por 512 píxeles, la velocidad de escaneo en ocho y la profundidad de datos en 12 bits. Establezca también el promedio de escaneo en uno, el zoom óptico a tres y pulse Intro.
A continuación, se el agujero a 1.95 unidades de error y la ganancia del detector a 582, que está justo por debajo de la saturación. Cree una región de interés en forma cuadrada para la adquisición de imágenes, que tenga las dimensiones de 150 por 150 píxeles. Configure la serie temporal de forma que la región de interés se escanee 35 veces, una vez cada 30 segundos.
A continuación, establezca el control de lejía de modo que el fotoblancada se produzca después del escaneo número cinco, para recoger cinco imágenes de prebleach de la región de interés. Pulse la tecla Intro para confirmar. A continuación, vaya a la ventana Regiones de lejía y cree una región de lejía en forma circular de interés dentro del área de estructura inducida similar a la agregosa, que tiene un diámetro de 10 píxeles.
Ahora, establezca el número de iteraciones en 300 y vuelva a pulsar la tecla Intro. A continuación, establezca la línea láser en 100% de potencia e introduzca 100 en el campo de porcentaje de transmisión para el láser y pulse Intro. Por último, ejecute el programa de adquisición de imágenes para recopilar datos FRAP de 10 estructuras inducidas similares a los agregadores en 10 celdas con menos de tres micras de deriva.
Para comenzar el análisis de datos, primero transfiera los archivos AIM lsm a un ordenador personal para el análisis de datos. Corrija la deriva de la imagen alineando o haciendo coincidir la pila de imágenes de series temporales de la región de adquisición de interés abriendo cada archivo AIM lsm con un programa de procesamiento de imágenes. A continuación, seleccione Plugins, Registration, StackReg y Translation, seguido de plugins, registration, StackReg y, a continuación, Rigid Body.
A continuación, configure el gestor de la región de interés para medir la intensidad de la señal en la región de lejía de interés. Para ello, seleccione la herramienta ovalada, luego dibuje un círculo en la región de lejía de interés con un diámetro de 10 píxeles y, a continuación, haga clic en el botón Agregar. Una vez añadido, configure el programa para medir la intensidad de la señal en la región de control de interés.
Seleccione la herramienta rectángulo, luego dibuje un cuadrado de 20 por 20 píxeles en la región de control y haga clic en el botón Agregar. Por último, configure el gestor de la región de interés para medir la intensidad de la señal en la región de fondo de interés. Seleccione la herramienta rectángulo, dibuje un cuadrado de 20 por 20 píxeles en la región de fondo y, a continuación, haga clic en el botón Agregar.
Después de agregar las regiones que se analizarán en ROI Manager, cámbieles el nombre de Bleach ROI, Control ROI y Background ROI, en consecuencia. Mida la intensidad de la señal en cada región. Para lograr esto, seleccione Bleach ROI, Control ROI y Background ROI y, a continuación, vaya a Más y seleccione Multi Measure.
Pegue los resultados en una hoja de cálculo en columnas etiquetadas como Bleach ROI, Control ROI y Background ROI, respectivamente. Comience por corregir en segundo plano la intensidad de la señal en el ROI de Bleach y el ROI de control restando los valores de la columna roi de fondo de los valores de la columna con la etiqueta Bleach ROI y la columna denominada Control ROI. Etiquete estas nuevas columnas Corrected Bleach ROI y Corrected Control ROI.
A continuación, normalice la señal en el ROI de Bleach a la señal corregida en segundo plano en el ROI de control. Divida los valores de la columna denominada CORREGIDOr ROI de blanqueo por los valores de la columna denominada ROI de control corregido. Etiquete esta nueva columna, Normalized Corrected Bleach ROI.
A continuación, normalice la señal de la columna ROI de lejía corregida normalizada al promedio de los cinco valores de prebleach en el ROI de Bleach. Divida los valores de la columna denominada Normalized Corrected Bleach ROI por el promedio de los cinco valores de prebleach en el ROI de Bleach. Etiquete esta nueva columna, Normalized Corrected Prebleach Average Bleach ROI.
Por último, abra un programa para el procesamiento de imágenes. La curva ajusta los datos de ROI de lejía normalizados y corregidos copiando los valores de ROI corregidos de postbleach y los valores de tiempo correspondientes. Péguelos en la ventana De ajuste de curva, seleccione recuperación exponencial en el menú desplegable Ajustar curva y seleccione Ajustar.
Aquí se muestra un video típico de recuperación de fluorescencia después de la fotoblancada para células RAW264.7 tratadas con LPS. La recuperación de la fluorescencia dentro de la región de estructura inducida por el agreso de interés, es lenta. Este experimento utiliza el fotoblanquido para examinar el grado de movilidad de p62.
la fluorescencia p62 en las estructuras inducidas similares a los agresos, prebleach y postbleach, se muestra aquí. Como se describe en este video, la intensidad de la fluorescencia se puede rastrear con el tiempo. Después de la corrección y normalización de fondo, la fluorescencia p62 se puede calcular para describir la fracción móvil como 22% la fracción inmóvil como 78% y describe el tiempo medio de recuperación dentro de las estructuras inducidas similares a los agregadores, como 2.14 minutos.
Recuerde que es especialmente importante definir adecuadamente la región de adquisición de interés para que incluya un ALIS de interés, una región de control de interés y una región de fondo de interés. Después de este procedimiento, se pueden aplicar otras técnicas cuantitativas de microscopía fluorescente, como la pérdida de fluorescencia en el fotoblancar, FLIP y fotoblancar selectivamente. Mientras que FLIP mide el grado de continuidad y comunicación entre los compartimentos subcelulares, el fotoblanchado selectivo proporciona información cinética sobre el transporte activo y pasivo de proteínas a orgánulos, o entre áreas ricas en proteínas.
FRAP fue desarrollado inicialmente para cuantificar el movimiento lateral de proteínas en las membranas celulares. Posteriormente, se ha utilizado para cuantificar la movilidad de proteínas dentro y entre una variedad de compartimentos subcelulares, lo que allanó el camino para que los investigadores respondieran a preguntas en una variedad de campos, incluyendo biología celular y molecular, biología del desarrollo, neurociencia, ciencia material, biomateriales avanzados y descubrimiento de fármacos.
