Nos gustaría dar las gracias a Jürgen Soll útil para los debates y Chris Carrie para la lectura crítica del manuscrito. Este proyecto fue financiado por la DFG y Fonds der Chemischen Industrie (números subvenciones SFB 1035, proyecto A04 a SS y Do 187/22 a RS).

1. Transformación de BiFC construcciones en las agrobacterias <ol><li> Clonación de construcciones BiFC <ol><li> Amplificar el gen de interés a partir de una plantilla adecuada utilizando oligonucleótidos que contienen sitios que flanquean attB-. Lleve a cabo una PCR utilizando una corrección de la polimerasa. Adaptar la longitud de la etapa de recocido a la combinación de cebadores diseñado y la longitud de la etapa de elongación de acuerdo con el tamaño del fragmento. Compruebe el producto de la PCR por electroforesis en gel de agarosa y purificar mediante el uso de un kit de PCR Clean-Up. </li><li> Lleve a cabo la reacción de BP con el fragmento obtenido y el vector de entrada usando una recombinasa BP. Mezclar 15-150 ng del producto attB-PCR con 150 ng del vector de entrada, añadir 2 l de la recombinasa BP y llenar con tampón TE hasta un volumen total de 8 l. Incubar la reacción durante 1 hora a TA y detener la reacción mediante la adición de 2 l de proteinasa K durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Transformar toda la reacción en E. competente coli DH5a; Células y la pantalla de las colonias obtenidas mediante PCR de colonias para la correcta inserción del fragmento de ADN en el vector. La secuenciación del ADN de los plásmidos positivos se realiza para verificar la ausencia de mutaciones. </li><li> Utilice la entrada clon obtenido por LR recombinación con el vector destino apropiado usando una recombinasa LR. Mezclar 50-150 ng del vector de entrada con 150 ng del vector de destino, añadir 1 l LR recombinasa y se llenan con tampón TE a un volumen total de 5 l. Incubar la reacción durante 1 hora a TA y detener la reacción mediante la adición de 1 l de proteinasa K durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Transformar la reacción completa en células de E. coli DH5a competentes y pantalla de colonias obtenidos mediante PCR de colonias para la correcta inserción del fragmento de ADN en el vector. La secuenciación de ADN no es necesario en este paso. </li><li> Aislar el ADN plásmido con un kit de plásmido mini para asegurar un alto grado de pureza. </li></ol></li><li> Preparación de agrobacterias químicamente competentes (AGL1 cepa, rifampicina y la resistencia a carbenicilina) <ol><li> Racha fuera agrobacteria de una cultura de valores y crecer durante 24 horas a 28 ° C. </li><li> Inocular 5 ml de medio LB con una sola colonia y se incuba durante la noche a 28 ° C. </li><li> Inocular 50 ml de medio LB con 2 ml del cultivo durante la noche y crecer durante aproximadamente 4 horas a 28 ° C a un OD 600 de 1,0. </li><li> Centrifugar las células a 3000 xg durante 15 min a 4 ° C y resuspender el precipitado en 1 ml esterilizados enfriada con hielo de CaCl 2 (10 mM). Mantener las células en hielo después de este paso. </li><li> Preparar alícuotas (100 l) de las células, congelar inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. </li></ol></li><li> Transformación de agrobacterias químicamente competente <ol><li> Descongelar una alícuota de células AGL1 competentes en hielo. Añadir 1-2 g de ADN plásmido a las células. Incubar durante 5 min en hielo, 5 min en nitrógeno líquido y 5 min a 37 ° C. Añadir 600 l de medio LB a las células y smerluza a 650 rpm durante 4 horas a 28 ° C. </li><li> Centrifugar las células durante 1 min a 8000 x g y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 50 l de medio LB restante y la placa sobre placas de LB que contenían los antibióticos apropiados. Tapar la placa e incubar durante 2 días a 28 ° C. Colonias de pantalla para la presencia del plásmido mediante PCR de colonias. </li><li> Inocular una colonia positiva en 5 ml de medio LB que contenía los antibióticos apropiados y se incuba a 28 ° C durante la noche. Mezclar 500 l de cultivo de una noche con 500 l 50% de glicerol esterilizado y congelar a -80 ° C. </li><li> Inocular las agrobacterias en medio LB que contienen los antibióticos apropiados directamente de la solución madre en glicerol para la transformación transitoria de las hojas de tabaco. </li></ol></li></ol> 2. Transformación Transitoria de hojas de tabaco <ol><li> Agrobacteria crecimiento <ol><li> Prepare las siguientes soluciones madre: Acetosiringona (150 mM, se disuelve en 70% EtOH), almacenar en alícuotas a -20 ° C. MES / KOH (0,1 M), pH 5,7, se almacenan a 4 ° C (filtro estéril a través de un filtro de 0,2 M a prevenir el crecimiento de bacterias durante el almacenamiento más largo), MgCl 2 (1 M) stock, almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Inocular 10 ml de medio LB que contenía los antibióticos apropiados con 50 l de la glicerol AGL1 de stock de cultivo que contiene el plásmido de interés en un tubo estéril de 50 ml y se incuba a 28 ° C durante al menos 24 horas de agitación a 190 rpm hasta una OD 600 entre 1,0 se alcanza -2.0. </li><li> Bacterias centrifugar a 3000 xg durante 15 min. Resuspender el sedimento en medio de infiltración recién hecho [MgCl2 (10 mM), MES / KOH (10 mM) pH 5,7, de Acetosiringona (150 M)] y ajustar la suspensión a un OD 600 de 1,0. </li><li> Se incuban las células Agrobacteria en un agitador de arriba durante 2 horas en la oscuridad. Las células luego se pueden utilizar para la infiltración. </li></ol></li><li> La infiltración de hojas de tabaco <ol><li> Utilice tressemanas de edad del tabaco (Nicotiana benthamiana) plantas. Seleccione varias hojas más viejas de la infiltración. </li><li> Mezclar volúmenes iguales de las agrobacterias que transportan los constructos de interés (3 ml cada uno). Tome una jeringa de 5 ml sin aguja para la infiltración. Infiltrarse en la suspensión de células cuidadosamente en las hojas de tabaco pulsando la jeringa en el lado inferior de las hojas en varios lugares. </li><li> Riegue las plantas y dejarlos en la oscuridad durante dos días. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de protoplastos Preparación de protoplastos de hojas de tabaco es una adaptación de Koop et al. 16 y ligeramente modificado. <ol><li> Preparación Buffer <ol><li> Preparar medio F-PCN: Macro-sales [KNO 3 (1,012 g / ml), CaCl2 • 2H 2 O (440 mg / ml), MgSO4 • 7H 2 O (370 mg / ml), KH 2 PO 4 ( 170 mg / ml), NH 4-succinato [(20 mM, preparar una acción de sol 2 Mlución (succinato (236 mg / ml) y NH 4 Cl (106 mg / ml), se ajustan a pH 5,8 para disolver)], Micro-sales [EDTA-Fe (III) x Na-sal (40 g / ml), KJ (0.75 g / ml), H 3 BO 3 (3 g / ml), MnSO4 • H2O (10 g / ml), ZnSO 4 • 7H 2 O (2 g / ml), Na 2 Moo 4 • 7H 2 O (0,25 g / ml), CuSO 4 • 5H 2 O (0,025 g / ml), COCl 2 • 6H 2 O (0,025 g / ml)], MES (390 mg / ml), glucosa (aproximadamente 80 g / ml) osmolaridad 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Almacenar en alícuotas a -20 ° C. </li><li> Preparar medio F-PIN: Todos los ingredientes como F-PCN pero en lugar de sacarosa glucosa uso (aproximadamente 110 g / ml), osmolaridad de 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Almacenar en alícuotas a -20 ° C. </li><li> Preparar medio W5: NaCl 150 mM, 125 mM de CaCl2, 5 mM de KCl, 2 mM de MES, osmolaridad 550-580 mOsm, pH 5,7 (KOH). Almacenar a 4 °; C (filtro estéril a través de un filtro de 0,2 micras para prevenir el crecimiento de bacterias durante el almacenamiento más largo). </li><li> Preparar la solución de enzima fresco para el aislamiento de protoplastos (0,1 g celulasa, 0,03 g macerozym en 10 ml de F-PIN). Se incuba la solución a 55 ° C durante 10 min y enfriar a ta. Añadir 100 l de 10% de BSA a 10 ml de solución. </li></ol></li><li> Aislamiento de protoplastos <ol><li> Coloque una hoja de infiltrado en una placa de Petri y la solución de enzima fresco. Utilice una nueva hoja de afeitar para cortar la hoja en aproximadamente 0,5 cm 2 piezas de tamaño. Transfiera los hoja-piezas con la solución de la enzima en un matraz infiltración al vacío y el vacío se infiltran por aproximadamente 20 segundos hasta que las burbujas de aire salen de las hojas (vacío liberación con mucho cuidado). </li><li> Agitar el matraz durante 90 minutos a 40 rpm en la oscuridad. </li><li> Soltar protoplastos por agitación durante 1 min a 90 rpm. Filtrar la solución a través de una gasa (100 M) en un tubo de centrifugación de 15 ml (fondo redondo). </li&gt; <li> Superposición de la solución de protoplastos con 2 ml de tampón F-PCN y centrifugar durante 10 min a 70 x g (aceleración y deceleración lenta) a TA. </li><li> Protoplastos intactos se acumulan en la interfase de la solución de enzima y F-PCN. Tome una punta ancha orificio de 1 ml pipeta para transferir los protoplastos intactos en un tubo de centrífuga fresco y rellenar con tampón W5. Centrifugar durante 2 min a 100 x g (aceleración y deceleración lenta) para sedimentar los protoplastos. </li><li> Eliminar el sobrenadante cuidadosamente usando una pipeta y Resuspender el sedimento en aproximadamente 200 l de tampón W5, dependiendo de la cantidad de protoplastos. </li><li> Utilice siempre puntas de los orificios de ancho para evitar ruptura de protoplastos intactos. </li></ol></li></ol> 4. Laser Scanning Microscopy <ol><li> Preparación de la muestra <ol><li> Pegue dos pequeñas tiras de sellador alrededor de un portaobjetos de microscopio (2 cm de distancia). Ponga 20 l de la solución de protoplastos entre las tiras y colocar cuidadosamente una cubierta de vidrioen la parte superior. Las tiras de sellador se aseguran de que los protoplastos no son aplastadas por la cubierta de vidrio. </li><li> Para el total de muestras de hojas cortan una pieza de 1 cm de la hoja y la colocan en un portaobjetos de microscopio con el lado inferior de la hoja hacia arriba. Añadir aproximadamente 30 l H 2 O, coloque una cubierta de cristal en la parte superior y fijarla firmemente con cinta adhesiva por ambos lados. </li></ol></li><li> Ajustes de imagen y microscopio confocal <ol><li> Formación de imágenes se realizó con un microscopio de barrido láser confocal de Leica, Tipo: TCS SP5. Para ampliación utilizar una lente de objetivo (HCX PL APO CS) con una magnitud de 63X con glicerol como medio de formación de imágenes. Ajuste la apertura numérica de 1,3. Utilice el software Leica Application Suite / Advanced fluorescencia para la evaluación (ver Datos Suplementarios S1). </li><li> Ajuste el láser de argón a 30% y la potencia del láser a 488 nm y una intensidad del 18% para monitorizar la señal BiFC reconstituido a 515 nm y establecer un ancho de banda de emisión detector PMT 495-550. </li&gt; <li> Para supervisar la autofluorescencia clorofila estableció un segundo de ancho de banda de emisión detector PMT 650-705. </li><li> Para monitorizar la señal mCherry utilizar el láser de He-Ne 561, ajuste la intensidad de láser de 561 a 18%, y el ancho de banda de la emisión de un tercer detector PMT 587-610. </li><li> Asegúrese de que las imágenes de todos los canales del detector PMT se toman con la misma configuración de ganancia (ganancia debe estar entre 800-900 para excluir las señales de fondo). </li><li> Hacer fotos en un formato de ancho / altura de 1024 x 1024 píxeles con una velocidad de barrido de 100 Hz. </li><li> Para Z-apilamientos utilizan una distancia máxima de 0,5 m entre cada pila. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Citovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).</li><li>Weinthal, D., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+in+plant+cells+by+bimolecular+fluorescence+complementation+assay.">Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay.</a> Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).</li><li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants.">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Lee, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+a+cDNA+library+for+protein-protein+interactions+directly+in+planta.">Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta.</a> Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).</li><li>McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ABCG+transporters,+which+are+required+for+export+of+diverse+cuticular+lipids,+dimerize+in+different+combinations.">Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations.</a> Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).</li><li>Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+studies+between+the+chloroplast+signal+recognition+particle+subunit+cpSRP43+and+the+full-length+translocase+Alb3+reveal+a+membrane-embedded+binding+region+in+Alb3+protein.">Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).</li><li>Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+GATEWAY+vectors+for+high+throughput+analyses+of+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).</li><li>Qbadou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+chaperone+Hsp90+delivers+precursor+proteins+to+the+chloroplast+import+receptor+Toc64.">The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64.</a> EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).</li><li>Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+is+a+chaperone+docking+protein+of+the+Sec+translocon+in+Arabidopsis.">AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis.</a> J. Cell Sci. , (2012).</li><li>Schweiger, R., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+as+part+of+the+Arabidopsis+Sec+post-translocon.">AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon.</a> Plant Signal Behav. 8, (2013).</li><li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants.">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51, 1126-1136 (2007).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li><li>Koop, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation.">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199, 193-201 (1996).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Después de la planificación de un experimento BiFC deben considerarse varios puntos. Aunque no se requiere ninguna información estructural de las proteínas de interés, la topología tiene que ser conocido cuando se trabaja con proteínas de membrana que abarca. Las proteínas fluorescentes tienen que residir en el mismo compartimento subcelular o enfrentar el mismo lado de una membrana para permitir la interacción. Naturalmente, cuando el análisis de proteínas que requieren una secuencia de orientación N-termin...

El estudio de la formación de complejos de proteínas y su localización en células vegetales in vivo es esencial para investigar las redes celulares, la señalización y los procesos metabólicos. BiFC permite la visualización de las interacciones proteína-proteína en su entorno natural directamente dentro de la célula de la planta de estar 1-5. En la BiFC acercarse a la complementación de dos fragmentos N-y C-terminales no fluorescentes de una ventaja de la proteína fluorescente a una proteína fluorescente reconstituido. Fragmentos de muchas proteínas fluorescentes diferentes se han utilizado para detectar interacciones de proteínas, por ejemplo, la proteína fluorescente verde (GFP) el cromóforo de que se forma químicamente por tres residuos distintos 6. Proteínas fluorescentes pueden reducirse a la mitad dentro de un bucle o ß-cadena para dar lugar a los dos fragmentos no fluorescentes que se pueden fusionar a ambas proteínas de interés. El ensayo se puede usar para detectar interacciones en cualquier compartme subcelularnt en cualquier organismo aeróbicamente creciente o células que se pueden modificar genéticamente para expresar las proteínas de fusión. Si las dos proteínas entran en estrecha proximidad dentro de la célula, la fluorescencia se reconstituye y se puede monitorizar mediante microscopía sin la adición de fluoróforos o colorantes exógenos 3. Tabaco (Nicotiana benthamiana) ha demostrado ser un organismo modelo conveniente de visualizar la interacción de proteínas de plantas, ya que las proteínas se pueden expresar fácilmente mediante la utilización de la transformación mediada por Agrobacterium de hojas de tabaco con las construcciones generadas. Agrobacterias utilizan un plásmido Ti llamado (inductor de tumores) que codifican enzimas que median la transducción del gen de interés en células de plantas. BiFC es así aplicable para solubles, así como para proteínas de la membrana dentro de todos los compartimentos celulares y ha sido utilizado con éxito en los últimos años para identificar las proteínas que interactúan in vivo, así como para analizar sitios de interaccióndentro de las proteínas 7-9. Tras la expresión de los genes introducidos, la interacción de las proteínas fluorescentes puede ser visualizada directamente en hojas, que es adecuado para estructuras celulares más grandes, tales como el retículo endoplasmático (ER), la membrana de plasma o cloroplastos. Sin embargo, para supervisar la localización en estructuras más refinadas, por ejemplo, la envoltura del cloroplasto, es aconsejable para visualizar la fluorescencia en protoplastos aislados a partir de hojas de tabaco transformadas. Un conjunto de vectores de BiFC que contienen ya sea un C-terminal o una etiqueta fluorescente N-terminal tiene que ser utilizado para el enfoque BiFC en las plantas 10. El protocolo se describe más adelante se utilizó para estudiar la interacción de citosólica proteína de choque térmico 90 (HSP90) con el tetratricopeptide repetir (TPR) de dominio que contiene proteínas de acoplamiento Toc64 y AtTPR7 que residían en la envoltura exterior del cloroplasto y el retículo endoplásmico, respectivamente 11-13. Para este propósito, la HSP90 se fusionó a la Ctparte erminal de SCFP (SCFP C). La etiqueta era N-terminal fusionado a la chaperona para garantizar la accesibilidad de la C-terminal motivo MEEVD unión de HSP90 para sujetar tipo dominios TPR. En paralelo, la parte N-terminal de Venus (Venus N) se fusionó a los dominios citosólicos de la TPR dominio que contiene proteínas de acoplamiento Toc64 y AtTPR7, respectivamente. Como control negativo se clonó la parte C-terminal soluble de SCFP C únicamente que reside en el citosol y por lo tanto es un control apropiado. Las etiquetas fluorescentes de las proteínas estudiadas tienen que enfrentar el mismo compartimento celular para permitir la proximidad y por lo tanto la reconstitución de la señal fluorescente. Para determinar la localización de la señal fluorescente reconstituido una proteína marcador fusionado a una etiqueta fluorescente diferente puede ser cotransformado para demostrar la localización subcelular de la interacción. Una proteína marcador ER fusionado a mCherrry fue transformado simultáneamente en elcaso de la sala de emergencia situada AtTPR7 14. La autofluorescencia de la clorofila se desempeñó como marcador de cloroplasto en caso de Toc64. Por esto no sólo la interacción in vivo de Toc64 y AtTPR7, respectivamente, con la chaperona HSP90 citosólica se puede monitorizar directamente en las hojas de tabaco, sino también la localización subcelular de la interacción puede ser investigado. BiFC Es muy adecuado como un enfoque complementario a otros métodos que estudian las interacciones proteína-proteína. En comparación con coimmunoprecipitation o en experimentos de pull-down in vitro, por ejemplo, no hay anticuerpos específicos tienen que estar disponibles para las proteínas de interés, y las proteínas no tienen que ser expresadas de forma recombinante in vitro, que puede ser un reto, especialmente para las proteínas de membrana. Por otra parte, también interacciones transitorias pueden ser controlados usando BiFC, ya que las proteínas son capturados por la interacción de las etiquetas fluorescentes fusionados 15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">3&#39;,5&#39;-Dimethoxy-4&#39;-hydroxyacetophenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">D134406</td>
			<td style="width:195px;">Acetosyringone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Cellulase, Onozuka-R10</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">16419</td>
			<td>from Trichoderma viridae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Macerozyme R-10&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">28302</td>
			<td>from Rhizopus sp</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:293px;">GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11789-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11791-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:255px;">27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td style="width:147px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:255px;">740609-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-GWVYNE</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-VYNE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:293px;">pDEST-SCYCE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves

Muchas proteínas interactúan de forma transitoria con otras proteínas o se integran en varios complejos de proteínas para llevar a cabo su función biológica. Complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) es un método in vivo para monitorear tales interacciones en las células vegetales. En el protocolo presentado las proteínas candidatas investigados se fusionan a mitades complementarias de proteínas fluorescentes y los respectivos constructos se introducen en las células vegetales a través de la transformación mediada por Agrobacterium. Posteriormente, las proteínas se expresan transitoriamente en hojas de tabaco y las señales fluorescentes restaurados se pueden detectar con un microscopio de barrido láser confocal en las células intactas. Esto permite no sólo la visualización de la interacción en sí misma, sino también la localización subcelular de los complejos de proteínas se puede determinar. Para este propósito, los genes marcadores que contienen una etiqueta fluorescente se pueden coexpressed junto con los constructos BiFC, visualizando de este modo las estructuras celulares tales como tél retículo endoplasmático, mitocondria, aparato de Golgi o la membrana plasmática. La señal fluorescente se puede controlar ya sea directamente en las células epidérmicas de la hoja o en protoplastos individuales, que pueden ser fácilmente aislado de las hojas de tabaco transformadas. BiFC es ideal para estudiar las interacciones proteína-proteína en su entorno natural dentro de la célula viva. Sin embargo, se tiene que considerar que la expresión tiene que ser impulsado por promotores fuertes y que los compañeros de interacción se modifican debido a la fusión de las relativamente grandes etiquetas de fluorescencia, lo que podría interferir con el mecanismo de interacción. Sin embargo, BiFC es un excelente enfoque complementario a otros métodos comúnmente aplicados investigan las interacciones proteína-proteína, como coimmunoprecipitation, vitro desplegable ensayos o experimentos en la levadura de dos híbridos.

En este ejemplo se utilizó el método BiFC para supervisar la interacción de la HSP90 citosólica chaperona molecular con las proteínas de unión a las membranas AtTPR7 y Toc64. AtTPR7 es parte de la translocón Sec y interactúa con chaperonas citosólicas, que posiblemente entregan preproteínas secretora para la translocación post-traducción a la membrana del RE. Del mismo modo, Toc64 en el sobre exterior cloroplasto actúa en la importación después de la traducción mediante la recepción de HSP90 preproteín...

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Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

protein-protein-interactions-visualized-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K vistas.  Ludwig-Maximilians-Universität, München.  Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas. 

Video: Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescencia de células activadas por la clasificación de los protoplastos de la planta

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Investigación

Biología

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) Ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

En vivo-La detección de interacciones proteína-proteína en la Micro-patrón superficies

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrofusión de células visualiza con microscopía de fluorescencia

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Fluorescencia de Complementación bimolecular

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

La investigación de las interacciones proteína-proteína en las células vivas utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...