Los supercomplejos son conjuntos supramoleculares formados por complejos de cadena respiratoria en la membrana interna-mitocondrial. La formación de estos supercomplejos se cree que confiere varias ventajas estructurales y funcionales, que incluyen la disminución de la producción de especies reactivas de oxígeno, estabilización y montaje más eficaz de complejos de cadena respiratoria individual, regulación de la actividad de la cadena respiratoria, y la prevención de la agregación de proteínas en el ambiente rico en proteínas de la membrana interna. Los cambios en el montaje y la composición de los supercomplejos son dinámicos, y se muestran cada vez más para subyacer a los cambios en la función mitocondrial observados durante la adaptación fisiológica, así como una variedad de enfermedades genéticas y adquiridas.
Este video presenta un protocolo PAGE nativo híbrido claro/azul para resolver y analizar supercomplejos de una manera precisa y eficaz en el tiempo. La principal ventaja de este método hybrid clear/blue native PAGE es que combina de forma óptima varios aspectos de los protocolos tradicionales de PAGE nativos azules y claros, lo que permite reducir al mínimo la exposición a detergentes y compuestos aniónicos en comparación con los protocolos publicados. La separación y el análisis óptimos de los supercomplejos se logran en geles de gradiente grande.
Este procedimiento implica varios pasos delicados que requieren habilidades manuales y una ejecución cuidadosa. La compatibilidad visual con el protocolo escrito proporciona consejos importantes que facilitan la implementación de la técnica. Demostrando el procedimiento está Alexandria, un estudiante de doctorado de mi laboratorio.
Para empezar, centrifugar las mitocondrias aisladas del tejido animal en un tubo de 1,5 mililitros a 16.000 veces-G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y agregue el volumen calculado de tampón de extracción de frío helado que contiene digitonina al tubo para resuspender el pellet mitocondrial. Coloque los tubos en un minivolador de tubo e incubar durante 30 minutos a cuatro grados centígrados a una velocidad de rotación media.
Centrifugar muestras a 20, 400 veces-G durante 45 minutos a cuatro grados Celsius para eliminar fragmentos insolubilizados. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo sobre hielo. Si la electroforesis no se realiza el mismo día, almacene las muestras a menos 80 grados centígrados.
Abra la cámara de fundición. Coloque una placa de vidrio exterior de 20 centímetros por 22 centímetros en la cámara. Coloque un conjunto de espaciadores de 1,5 mililitros utilizando la tarjeta de alineación para asegurarse de que están firmemente asentados contra el lado y las esquinas de la cámara.
Coloque una placa de vidrio interior en la parte superior de los espaciadores para formar el sándwich de gel, y coloque una hoja de separación de plástico en la parte superior de la placa de vidrio. Organice tres sándwiches de gel más. Agregue más bloques de acrílico o placas de vidrio si es necesario para ocupar el espacio restante en la cámara.
Coloque una tira de parafilma en la ranura antes de colocar la junta firmemente en la muesca de la junta. Coloque la placa de techo en la cámara y apriete los seis tornillos. Párese la cámara de fundición.
Coloque el gradiente anterior en una placa de agitación con un agitador magnético en la cámara de mezcla de luz. Conecte el tubo de la cámara de fundición al primero degradado y fije el tubo en el cassette de la bomba peristáltica. Asegúrese de que el llave denda del primero degradado está cerrado.
Para fundir cuatro geles, preparar 60 mililitros de 4% y 60 mililitros de soluciones de 12% gel en dos matraces Erlenmeyer, y girar a fondo para mezclar. Vierta la solución de 4% gel en la cámara de mezcla ligera, y el 12% en la cámara de depósito pesado del primero degradado. Ajuste la velocidad de agitación de la placa de agitación a 350 rpm.
A continuación, abra la llave y encienda la bomba a 35 rpm. Una vez que el nivel de solución de la fracción de luz sea inferior a la fracción pesada, detenga la bomba y abra el vástago de la válvula entre los depósitos ligeros y pesados. Deje que el volumen de las fracciones se equilibre y reinicie la bomba.
Asegúrese de que no entren burbujas en el sistema y queden atrapadas entre las placas de vidrio. Una vez que el gel degradado esté completamente vertido, detenga la bomba y superponga un mililitro de agua en cada sándwich de gel para evitar el secado del gel. Dejar que se polimerice durante dos horas.
Preparar gel apilable de 25 mililitros en el matraz Erlenmeyer y remolino para mezclar bien. Invierta delicadamente el montaje para eliminar el agua e inserte peines de 15 pozos en cada sándwich de gel. Verter gel de apilamiento y dejar que se polimerice durante dos horas.
Después de eso, inserte las abrazaderas de gel y sándwich y retire el peine. Con la placa de vidrio corta hacia abajo, inserte el sándwich de gel en el núcleo de enfriamiento. Repita en el otro lado y coloque el núcleo en el tanque de electroforesis.
Vierta 300 mililitros de tampón de cátodo azul en la cámara interior del tanque de electroforesis. Con una pipeta y puntas de carga, cargue de 75 a 175 microgramos de proteína por pozo. En la sala fría a cuatro grados centígrados, conecte los electrodos a la fuente de alimentación y enciéndalo a 150 voltios, y ejecute el gel durante una hora y media, o hasta que las muestras hayan entrado en el gel de gradiente.
Carga de réplicas de la muestra en pozos separados para permitir la determinación paralela de las actividades en gel y el análisis de inmunoblot de los complejos OXPHOS. Retire el tampón de cátodo azul con pipeta. Reemplazar por 300 mililitros de Coomassie azul libre de cátodo, y ejecutar gel a 200 voltios durante la noche en la sala fría.
Antes del final de la electroforesis, preparar tampones de actividad en gel de acuerdo con el manuscrito, y mantenerlos en la oscuridad a temperatura ambiente. Detenga la electroforesis y recupere el gel. Cortar la bolsa de plástico para que se pueda abrir como un libro.
Corte los carriles y transfiera los carriles de gel a las bolsas de plástico. Utilice un sellador térmico para sellar dos de los tres lados. Si se realizan experimentos de control negativo, agregue inhibidores a los búferes de ensayo.
Para tres muestras experimentales, agregue 20 mililitros de tampón de actividad en gel. Retire las burbujas y selle el cuarto lado de la bolsa de plástico. Incubar carriles de gel a 37 grados centígrados en la oscuridad y comprobar cada 15 minutos.
El tiempo de incubación varía dependiendo de la cantidad de proteínas y complejos. Después de la incubación, enjuague los carriles de gel en agua para detener la reacción, y la imagen sobre un fondo blanco para el complejo I, complejo II, complejo IV, o fondo negro para el complejo V.Para este ejemplo, se realizó una actividad in-gel IV compleja para visualizar supercomplejos aislados de las mitocondrias hepáticas de ratón fresco. La cantidad óptima de digitonina para esta muestra es de cuatro gramos por gramo, ya que proporciona una buena resolución del complejo monomérico IV, y supercomplejos de alto peso molecular.
En una proporción más baja, las bandas no son claras y se resuelven en un frotis durante la electroforesis, mientras que el uso de una mayor proporción de digitonina conduce a la interrupción de los supercomplejos de alto peso molecular. Las mitocondrias hepáticas aisladas de un ratón fueron tratadas con la cantidad óptima de digitonina para extraer supercomplejos respiratorios. La movilidad electroforética de los complejos OXPHOS se reduce ligeramente cuando las proteínas se separan utilizando condiciones de PAGE nativas híbridas claras/azules, en comparación con la PÁGINA nativa estándar, debido a la menor cantidad de coomassie azul.
Este cambio de movilidad es mayor para monómeros INTRA complejos, seguido de monómeros V complejos, y complejo I.El fondo azul es más bajo en la página nativa nativa/azul híbrida clara en comparación con la página nativa azul. Los altos niveles de fondo que siguen a blue native PAGE enmascaran completamente la tinción de actividad en gel para el complejo II, y mejoran el ruido de fondo asociado con la actividad de los dimers IV complejos. Para este protocolo, la valoración de las muestras de interés con varias cantidades de digitonina es fundamental para identificar las condiciones que permiten una solubilización óptima, preservando al mismo tiempo la actividad enzimática y las interacciones fisiológicas de proteínas.
Todos los pasos relativos a la fundición de gel deben realizarse meticulosamente a la formación de un gradiente óptimo para una separación adecuada de la muestra. También se debe tener mucho cuidado por la manipulación de estos geles grandes y frágiles. Sosténgalos siempre con varios dedos usando el extremo de alto porcentaje del gel.
Con este método híbrido de PAGE nativo claro/azul, las muestras sólo se exponen brevemente al colorante aniónico Coomassie azul al comienzo de la electroforesis sin exposición a ningún otro detergente. Esto permite separar y resolver supercomplejos tan eficazmente como con los métodos tradicionales nativos de la página azul, evitando al mismo tiempo el efecto negativo de los altos niveles de coomassie azul en los ensayos de actividad en gel y las interacciones proteína-proteína lábiles dentro de los supercomplejos. Con este protocolo, por lo tanto, es posible combinar mediciones precisas y rápidas de la actividad en gel con técnicas analíticas que implican electroforesis 2D, inmunodetección y/o análisis proteómico referenciado de supercomplejos.
