التراكبات الفائقة هي جمعيات فوق مركّبة على الجهاز التنفسي تتكون من سلسلة من المركبات التنفسية في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا. ويعتقد أن تشكيل هذه supercomplexes لمنح العديد من المزايا الهيكلية والوظيفية، والتي تشمل انخفاض إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية، والاستقرار وتجميع أكثر فعالية من مجمعات سلسلة التنفس الفردية، وتنظيم نشاط سلسلة التنفس، ومنع تجميع البروتين في البيئة الغنية بالبروتين من الغشاء الداخلي. التغيرات في تجميع وتكوين supercomplexs هي ديناميكية، وتظهر على نحو متزايد أن تكمن وراء التغيرات في وظيفة الميتوكوندريا لوحظت أثناء التكيف الفسيولوجية، فضلا عن مجموعة متنوعة من الأمراض الوراثية والمكتسبة.
يعرض هذا الفيديو بروتوكول PAGE الأصلي /الأزرق المختلط لحل وتحليل التراكبات بطريقة دقيقة وفعالة للوقت. والميزة الرئيسية لهذا الهجين واضحة / الأزرق الأصلي طريقة PAGE هو أنه يجمع على النحو الأمثل بين جوانب مختلفة من بروتوكولات صفحة التقليدية الزرقاء والمسحية الأصلية ، والتي تسمح للحد من التعرض للمنظفات والمركبات anionic إلى أدنى حد ممكن مقارنة بالبروتوكولات المنشورة. ويتحقق الفصل الأمثل وتحليل supercomplexs على المواد الهلامية تدرج كبير.
يتضمن هذا الإجراء عدة خطوات دقيقة تتطلب مهارات يدوية وتنفيذ دقيق. يوفر الدعم المرئي للبروتوكول المكتوب نصائح هامة تسهل تنفيذ هذه التقنية. مما يدل على الإجراء هو الإسكندرية، وهو طالب دكتوراه من مختبري.
للبدء، الطرد المركزي الميتوكوندريا معزولة عن الأنسجة الحيوانية في أنبوب 1.5 ملليلتر في 16، 000 مرة-G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. تجاهل supernatant وإضافة الحجم المحسوب من الجليد الباردة استخراج العازلة التي تحتوي على digitonin إلى أنبوب لإعادة ربط بيليه الميتوكوندريا. ضع الأنابيب على دوار أنبوب صغير واحتضان لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية بسرعة دوران متوسطة.
عينات من أجهزة الطرد المركزي في 20، 400 مرة-G لمدة 45 دقيقة في أربع درجات مئوية لإزالة الشظايا غير المُحلة. نقل المُندفع إلى أنبوب جديد على الجليد. إذا لم يتم إجراء الكهرباء في نفس اليوم، تخزين العينات في ناقص 80 درجة مئوية.
افتح غرفة الصب. ضع 20 سنتيمترًا × 22 سنتيمترًا في اللوحة الزجاجية الخارجية في الغرفة. ضع مجموعة واحدة من الفواصل 1.5 ملليلتر باستخدام بطاقة المحاذاة لضمان جلوسها بقوة ضد جانب وزوايا الغرفة.
وضع لوحة زجاجية داخلية على رأس الفواصل لتشكيل شطيرة هلام، ووضع ورقة فصل من البلاستيك على رأس لوحة زجاجية. ترتيب ثلاثة أكثر هلام ساندويتش الجمعية. إضافة المزيد من كتل الاكريليك أو لوحات الزجاج إذا لزم الأمر لتولي المساحة المتبقية في الغرفة.
وضع شريط من parafilm في الأخدود قبل الجلوس طوقا بحزم في الشق طوقا. ضع لوحة السقف على الغرفة وشد جميع مسامير الستة. الوقوف على غرفة الصب.
ضع التدرج السابق على لوحة ضجة مع مُحرك مغناطيسي في غرفة الخلط الخفيفة. توصيل أنابيب من غرفة الصب إلى الانحدار السابق، وتأمين الأنابيب في الكاسيت من مضخة ال peristaltic. تأكد من إغلاق stopcock من الانحدار السابق.
لإلقاء أربعة هلام, إعداد 60 ملليلتر من 4٪ و 60 ملليلتر من حلول هلام 12٪ في اثنين من قارورة Erlenmeyer, ودوامة تماما لخلط. صب حل هلام 4٪ في غرفة الخلط الخفيفة، و 12٪ في غرفة الخزان الثقيلة من الانحدار السابق. تعيين سرعة اثارة لوحة اثارة في 350 دورة في الدقيقة.
ثم افتح الـ stopcock وقم بتشغيل المضخة عند 35 دورة في الدقيقة. مرة واحدة في مستوى حل الكسر الضوء هو أقل من الكسر الثقيل، وقفة المضخة وفتح الجذعية صمام بين الخزانات الخفيفة والثقيلة. السماح كسور اكويرات حجم وإعادة تشغيل المضخة.
تأكد من عدم إدخال أي فقاعات النظام والحصول على المحاصرين بين لوحات الزجاج. بمجرد صب جل التدرج بالكامل ، أوقف المضخة وتراكب الماء على كل شطيرة هلام لمنع تجفيف الجل. دعها تُتَمَرّر لمدة ساعتين
إعداد 25 ملليلتر التراص هلام في قارورة Erlenmeyer ودوامة لخلط دقيق. عكس بدقة المونتاج لإزالة الماء، وإدراج 15-جيدا أمشاط في كل شطيرة هلام. صب هلام التراص والسماح لها البلمرة لمدة ساعتين.
بعد ذلك، إدراج جل ومشابك شطيرة وإزالة مشط. مع لوحة زجاجية قصيرة تواجه لأسفل، إدراج شطيرة هلام في الأساسية التبريد. كرر على الجانب الآخر ووضع الأساسية في خزان الكهرباء.
صب 300 ملليلتر من العازلة الكاثود الأزرق في الغرفة الداخلية للدبابات الكهرباء. مع ماصة ونصائح التحميل، تحميل 75 إلى 175 ميكروغرام من البروتين في البئر. في غرفة باردة في أربع درجات مئوية، قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية في إمدادات الطاقة وتحويلها إلى 150 فولت، وتشغيل هلام لمدة ساعة ونصف، أو حتى عينات دخلت كل هلام التدرج.
تحميل تكرارات من العينة في آبار منفصلة لتمكين تحديد موازي للأنشطة في هلام وتحليل مناعي من مجمعات OXPHOS. إزالة العازلة الكاثود الأزرق مع ماصة. استبدال 300 ملليلتر من Coomassie الأزرق الحر الكاثود العازلة، وتشغيل هلام في 200 فولت بين عشية وضحاها في غرفة باردة.
قبل نهاية الكهرباء، قم بإعداد مخازن النشاط في الجل وفقا للمخطوطة، والاحتفاظ بها في الظلام في درجة حرارة الغرفة. وقف الكهرباء واسترجاع هلام. قطع كيس من البلاستيك بحيث يمكن فتحه مثل كتاب.
قطع الممرات ونقل الممرات هلام في أكياس بلاستيكية. استخدام مسيل الحرارة لختم اثنين من الجوانب الثلاثة. إذا تم إجراء تجارب التحكم السلبية، أضف مثبطات إلى مخازن الفحص.
لثلاث عينات تجريبية، أضف 20 ملليلتر من عازل النشاط في هلام. إزالة فقاعات وختم الجانب الرابع من كيس من البلاستيك. احتضان الممرات هلام في 37 درجة مئوية في الظلام والتحقق من كل 15 دقيقة.
وقت الحضانة يختلف تبعاً لكمية البروتين والمجمعات. بعد الحضانة، وشطف الممرات هلام في الماء لوقف رد الفعل، وصورة على خلفية بيضاء لـ I معقدة، II معقدة، IV معقدة، أو خلفية سوداء لV.for هذا المثال، تم تنفيذ نشاط IV في هلام معقدة لتصور supercomplexes معزولة عن الميتوكوندريا الكبد الماوس الطازجة. المبلغ الأمثل من digitonin لهذه العينة هو أربعة غرامات في الغرام الواحد، كما أنه يوفر دقة جيدة من الرابع مجمع أحادية اللون، وارتفاع الوزن الجزيئي supercomplexes.
في نسبة أقل، العصابات ليست واضحة وحل في مسحة خلال electrophoresis، في حين أن استخدام نسبة أعلى من digitonin يؤدي إلى تعطيل supercomplexes الوزن الجزيئية العالية. تم التعامل مع الميتوكوندريا الكبد معزولة من فأر واحد مع كمية الأمثل من digitonin لاستخراج supercomplexes الجهاز التنفسي. يتم تقليل الحركة الكهربائية للمجمعات أوكسفوس قليلا عندما يتم فصل البروتينات باستخدام شروط الصفحة الأصلية الهجينة واضحة / زرقاء، مقارنة مع الصفحة الأصلية القياسية، وذلك بسبب انخفاض كمية الأزرق Coomassie.
هذا التحول التنقل أكبر للمونومات الرابع المعقدة، تليها أحادية V معقدة، والخلفية I.The الزرقاء المعقدة أقل في صفحة أصلية أصلية/ زرقاء مختلطة واضحة مقارنة بصفحة أصلية زرقاء. مستويات خلفية عالية بعد الأزرق الأصلي PAGE أقنعة تماما في هلام النشاط تلطيخ لII معقدة، ويعزز الضوضاء الخلفية المرتبطة بنشاط dimers الرابع المعقدة. لهذا البروتوكول، المعايرة من العينات من الفائدة مع كميات مختلفة من digitonin أمر بالغ الأهمية من أجل تحديد الظروف التي تسمح solubilization الأمثل، مع الحفاظ على نشاط الانزيم والتفاعلات البروتين الفسيولوجية.
وينبغي أن تؤدي جميع الخطوات المتعلقة صب هلام بدقة لتشكيل التدرج الأمثل لفصل العينة السليمة. وينبغي أيضا توخي الحذر الشديد للتلاعب في هذه المواد الهلامية الكبيرة والهشة. عقد دائما لهم مع عدة أصابع باستخدام نهاية نسبة عالية من هلام.
مع هذا الهجين واضحة / الأزرق الأصلي طريقة PAGE، يتم فقط يتعرض عينات لفترة وجيزة إلى صبغة anionic Coomassie الأزرق في بداية الكهرباء دون التعرض لأية منظفات أخرى. وهذا يسمح لفصل وحل supercomplexes على نحو فعال كما هو الحال مع أساليب الصفحة الأصلية الزرقاء التقليدية، مع تجنب التأثير السلبي لمستويات Coomassie الزرقاء العالية على مقايسات النشاط في هلام وتفاعلات البروتين البروتينية في إطار supercomplexes. مع هذا البروتوكول، فمن الممكن بالتالي الجمع بين قياسات النشاط في هلام دقيقة وسريعة مع التقنيات التحليلية التي تنطوي على الكهربائي 2D، المناعي، و / أو تحليل البروتيوميات المشار إليها من supercomplexes.
