Un perfil SEC es una forma poderosa de analizar la calidad de una proteína. El objetivo es recopilar un perfil SEC para una proteína de membrana utilizando fluorescencia, que puede informar sobre la calidad de la muestra. FSEC utiliza pequeñas cantidades de muestra y se puede llevar a cabo para la purificación, es relativamente simple y se puede llevar a cabo en equipos disponibles en muchos laboratorios.
Demostrando el procedimiento estará Jack Wright, un científico senior de proteínas de Peak Proteins. Comience por la preparación de las paletas de celdas descongelando la paleta de celdas almacenada a menos 80 grados centígrados a temperatura ambiente durante 15 minutos, o hasta que la muestra ya no esté congelada. Mueva la muestra inmediatamente al hielo.
Para volver a suspender y solubilizar la muestra, agregue dos mililitros del tampón de solubilización a la paleta de celdas. Incubar con inversión de extremo a extremo a cuatro grados centígrados durante 15 a 30 minutos. Luego agregue el stock de detergente premezclado para hacer una concentración final de maltósido de dodecilo al 1%, o DDM, y hemisuccinato de colesterol al 0.1%, o CHS.
Solubilizar durante 30 minutos con inversión de extremo a extremo a cuatro grados centígrados. Para realizar un paso de centrifugación a baja velocidad, centrifugar la muestra en una centrífuga de sobremesa con un cucharón abatible y centrifugar a 2000 g durante 15 minutos. Luego realice la centrifugación de alta velocidad transfiriendo el sobrenadante de la centrifugación de baja velocidad a los tubos de ultracentrifugación utilizando una aguja de punta roma conectada a una jeringa de cinco mililitros.
Asegúrese de no perturbar la paleta. Después de equilibrar los pares de tubos, colóquelos en un rotor de ultracentrifugación de ángulo fijo y centrifugar a cuatro grados centígrados durante 30 minutos a 250, 000 g. Prepare el sistema de cromatografía líquida de proteínas rápidas, o FPLC, llenando el sistema con cromatografía de exclusión de tamaño, o tampón SEC, y purgando las bombas de aire.
Conecte la columna SEC al FPLC, asegurándose de que no entre aire en la columna. Preequilibre la columna SEC lavándola en volúmenes de columna 1.5 veces de agua destilada y filtrada de grado de laboratorio, seguido de volúmenes de columna 1.5 veces de tampón SEC al caudal y presión recomendados para la columna. Para ejecutar el experimento SEC, transfiera el sobrenadante del paso de centrifugación de alta velocidad a una jeringa de un mililitro usando una aguja roma conectada a la jeringa.
Establezca el bucle de ejemplo para cargar. Llene demasiado un circuito de muestra de 500 microlitros inyectando de 600 a 700 microlitros de la muestra de la jeringa en el puerto de carga. A continuación, inyecte la muestra del bucle en la columna vaciándola con cuatro mililitros de tampón SEC al caudal y la presión recomendados.
Ejecute la columna al mismo caudal hasta el paso de 1,5 veces el volumen de amortiguación, y comience a recolectar 90 fracciones de 0,2 mililitros después de pasar 0,25 veces el volumen de la columna. Usando una pipeta multicanal, transfiera 90 microlitros de agua destilada de grado de laboratorio desde un depósito a cada pocillo de una placa opaca, de fondo plano y 96 pocillos. Luego transfiera los 10 microlitros de las muestras de una placa de 96 pocillos a la placa opaca, de fondo plano y de 96 pocillos, y coloque la placa de pocillo en un lector de placas.
Para el GFP marcado con fluorescencia, et la excitación lo más cerca posible de 488 nanómetros y detectar la emisión fluorescente lo más cerca posible de 507 nanómetros antes de medir la señal. La investigación del rango dinámico y los límites inferiores de la proteína fluorescente verde mejorada, o detección de EGFP para el lector de placas, indicó que el lector de placas tenía un límite de detección inferior de 30 nanogramos y un rango dinámico de hasta 500 nanogramos de proteína marcada con EGFP por pozo antes de la saturación de la señal. La conversión de los volúmenes de elución a Kav y su trazado contra pesos moleculares logarítmicos permitió estimar el peso molecular de los receptores acoplados a proteínas G mediante interpolación de la curva estándar.
Las condiciones óptimas de extracción por membrana se exploraron probando el DDM y lauril maltosa neopentil glicol contra la extracción sin detergente con copolímero de ácido maleico estireno. El efecto de la adición de ligandos en el perfil de cromatografía de exclusión de tamaño de fluorescencia se investigó mediante la adición de esfingosina-1-fosfato, o S1P, a la muestra durante la solubilización. La muestra solubilizada en presencia de S1P mostró una traza superior con agregación reducida.
La investigación de la estabilidad a largo plazo del receptor de serotonina 5HT2AR en diferentes condiciones indicó que la proteína en las partículas lipídicas de ácido maleico estireno permaneció estable durante más tiempo, incluso a temperaturas desfavorables. El tiempo entre el punto de solubilización y la muestra que pasa por la columna SEC es crítico en el tiempo. No debe haber pausas y la muestra debe mantenerse fría.
Después de FSEC, se obtendrá una comprensión de la mejor construcción, detergente o tampón. Esto permite optimizar la purificación de proteínas y apoya la caracterización biofísica y estructural aguas abajo.
