SEC-MALS çözeltideki makromoleküllerin molekül ağırlığını, boyutunu ve konformasyonunun belirlenmesinde kullanılan nicel bir yöntemdir. Oligomerları ve kompleksleri belirleyebilir ve glikoproteinler ve membran proteinleri gibi zor örnekleri karakterize edebilir. SEC-MALS mutlak bir yöntemdir.
Temel fiziğe dayanır ve moleküler standartlara, molekülün konformasyonuna veya ayırma ortamıyla nasıl etkileşime girdiğimizi karşılaştırır. SEC-MALS, sn ile ayrılan birçok sistemiçin uygulanabilir. Peptitler ve küçük polimerlerden proteinlere, nükleokapsidlere, polisakkaritlere, sentetik polimerlere, virüs benzeri parçacıklara ve küçük virüslere kadar.
Sisteminizin ve arabelleklerinizin düşük partikül içeriği için satıcının önerilerini kaçırdığını doğrulamak önemlidir. Emin olmak için satıcının teknik destek temsilcisine danışın. Metin protokolünde açıklandığı gibi SEC-MALS sisteminin hazırlanması ile bu yordamı başlatın.
Her PLC dereceli reaktifleri kullanarak, 50 ila 100 milimolar sodyum klorür ile fosfat tamponlu tuz bir litre hazırlamak. Tamponu, şişelenmiş bir hücre köpük filtresi veya benzeri bir şişe kullanarak 0,1 mikrona filtre uygulayın. Kuru filtrelerdeki partikülleri ortadan kaldırmak için ilk 50 ila 100 mililitre tamponu atık şişeye süzün.
Daha sonra, daha önce filtrelenmiş, deiyonize su ile yıkanmış ve toz girmesini önlemek için tutulan temiz, steril bir şişe için geri kalanı filtre. Arabellekteki sütunu dengelemek ve partikülleri gidermek için kolonu bir gecede dakikada 0,5 mililitre lik bir akış hızıyla temizleyin. FPLC'nin sürekli akış modunu kullanın ve tüm SEC-MALS çalıştırmaları tamamlanana kadar akışın durmadığından emin olun.
DrI akış hücresini bir gecede yıkama sırasında temizleme moduna yerleştirin. Floş başlarken, sütundaki ani basınç değişikliğinden kaynaklanan sütun dökülme etkisini önlemek için akış hızını kademeli olarak artırın. Örnek çalıştırmaya başlamadan önce temizlemeyi kapatın.
Birikmiş parçacıkları serbest bırakmak için sütunun boru akıntısına hafifçe dokunarak sistem temizliğini kontrol edin. MALS cihazının ön panel ekranındaki 90 derecelik dedektördeki sinyali gözlemleyin. Tepeden tırnama gürültüsünün en fazla 50-100 mikrovolt olduğunu doğrulayın.
Ayrıca, kırılma indisi veya RI sinyalinin eksi yedi kırılma indisi birimine 1 katından daha az bir şekilde sabit olduğunu doğrulayın. Enjektörün parçacıklardan temiz olduğunu doğrulamak için boş bir enjeksiyon yapın. Boş sadece çalışan tampon taze, steril bir şişe içinde hazırlanmıştır.
Parçacık tepe hacmi en fazla bir mililitre ve taban çizgisi üzerinde en fazla beş milivolt ise, o zaman sistem örnekleri için hazırdır. Aksi takdirde, temiz olana kadar ek boş enjeksiyonlar yapın veya enjektörü temizlemek için bakım yapın. Şimdi, SCC tamponunda mililitre başına bir ila iki miligram da en az 200 mikrolitre BSA hazırlayın.
Bir şırınga ucu filtresi kullanarak proteini 02 mikrona filtre uygulayın. Kuru filtrelerden parçacıkları ortadan kaldırmak için ilk birkaç damla filtrat atın. Alternatif olarak, çözünmeyen agregaların ve diğer büyük parçacıkların çökebilmesini sağlamak için numuneyi 10,000 kez G'de on beş dakika santrifüj edin.
Daha sonra, döngü içine BSA çözeltisi 100 mikrolitre enjekte. MALS yazılım menüsünde yöntemden yeni deneme açın. Ardından, ışık saçılma sistemi yöntemleri klasöründen çevrimiçi yöntemi seçin.
Bir DLS dedektörü varsa, QELS klasörü ile ışık saçılma çevrimiçi yöntemini seçin. Yapılandırma bölümünde numune ve mobil faz parametrelerini ayarlayın. Genel pompa görünümünde, akış hızını FPLC'de kullanılana ayarlayın.
Ardından, genel pompa görünümüne, çözücü dalına, ad alanına gidin ve PBS'yi seçin. Enjektör görünümünde, örnek dal, BSA olarak adı girin. Dn/dc'yi 0,185 olarak ayarlayın, A2'yi 0'a ayarlayın ve UV Yok Olma Katsayısını milimetre nin santimetreküpü 0,667 mililitreye ayarlayın.
Yordamlar bölümünde, temel toplama görünümünde, otomatik enjekte üzerindeki onay kutusu tetikleyicisini seçin. SEC sütununun toplam geçirim hacmine ulaşılAna kadar verilerin tüm tüm kisiyon için toplanması için çalışma süresini 70 dakikaolarak ayarlayın. Çalıştır düğmesini tıklatarak MALS yazılımındaki denemeyi başlatın.
MALS dedektörü aracılığıyla FPLC cihazından darbe sinyali aldıktan sonra verileri okumaya başlayacaktır. Cihazın ön panelindeki otomatik sıfır düğmesini tıklatarak DRI sinyalini sıfırla. FPLC yazılımında çalışarak, el ile gidin, manuel yönergeleri çalıştırın, işareti ayarlayın ve protein ve çalıştırmanın adını ekleyin.
Enjeksiyon valfini manuel yükten enjeksiyona, akış yolunun altına, enjeksiyon vanasına geçirin. IO kutusu nabız dijital altında 0,5 saniyelik darbe ekleyerek bir darbe sinyali ekleyin. Bu, MALS yazılımında veri toplamayı tetikler.
Şimdi, örneği döngüye enjekte edin. Deneme çalışmasını başlatmak için FPLC yazılımında çalıştır'ı tıklatın. MALS yazılımındaki yordamlar bölümü altında, analizleri adım adım gerçekleştirin.
Temel koleksiyon görünümünü kontrol ederek, zirvelerin UV, MALS ve RI'de yaklaşık olarak aynı kinayon hacminde göründüğünü doğrulayın. Taban çizgisi görünümünde, tüm sinyaller için taban çizgisini tanımlayın. Zirvegörünümünde, fareyi tıklatıp sürükleyerek analiz edilecek zirveleri tanımlayın.
Her tepenin merkezi %50'sini seçin. Önce monomer tepesini, sonra dimer tepesini seçin. Her tepenin altında, BSA için 280 nanometre de dn/dc ve yok olma katsayısının doğru değerlerini doğrulayın.
Yordamlarda hizalama görünümünde, fareyi tıklatıp sürükleyerek zirvelerin merkezi bölgesini seçin. Sinyalleri hizala'yı tıklatın ve sonra tamam. Yordamlarda, bant genişletme görünümü, monomer tepe merkezi% 50 seçin.
Kırılma indisi dedektörü referans aracı olarak belirtildiğinden emin olun. Ardından uygun performansı tıklatın ve UV ve ışık saçılma sinyallerini kırılma indisi sinyaliyle eşleştirmek için uygulayın. Merkezi %50-70 arasında çok yakın örtüştüğünü doğrulamak için zirveleri yakınlaştırın ve tamam'ı tıklatın.
Yordamlar, normalleştirme görünümünde, tepe bir seçin. RG değeri olarak 3,0 nanometre girin, normale döndür'e tıklayın ve sonra tamam'ı tıklatın. EASI grafik görünümünde sonuçların grafiğini görüntüleyin.
Ekranın üst kısmında aşağı açılan molar kütle seçin. En tepe bölgesine yakınlaştırmak için denetimi, tıklatmayı ve sürükleyin'i kullanın. Monomer ve dimer zirveleri için son tablolanmış ağırlık ortalama molar kitle sonuçlarını görüntülemek için, tepe sonuçlarına, molar kütle momentlerine, MW'ye gidin ve sonuçlara seçin, özet rapor.
Saflık pik sonuçlar altında rapor edilir, kütle fraksiyonu. Dosya menüsünden yöntem olarak kaydet'i seçin ve analiz edilen BSA verilerini tüm protein türlerinin gelecekteki ölçümleri için standart bir yöntem olarak kaydedin. Analizde BSA için belirlenen normalleştirme ve bant genişletme parametreleri gerçekleştirilecektir.
Burada gösterilen 200 Angstrom gözenek boyutu dışlama sütunu kullanarak, BSA SEC-MALS analizleri vardır. Kromatogram izleri monomer tepeye normalleştirilmiş ve netlik için ofset. Göz ardı edilebilecek ortak yapılar, ışık saçılma sinyalinin başlangıcına yakın bir parçacık zirvesinin yanı sıra kırılma indisi sinyalindeki toplam permeasyon hacmine yakın tuz ve çözünmüş hava zirveleri de dahil olmak üzere işaret edilir.
Kromatogram mükemmel monomer-dimer-trimer ayırma sergiler, ve ışık saçılma sinyali gürültüye yüksek sinyal sergiler. Monomer ve dimer ağırlık ortalama molar kütle değerleri yüksek homojenlik gösterir. Aşağıda düşük kaliteli SEC-MALS analizlerine örnekler verilmiştir.
Bu örnekte, 75 Angstrom gözenek boyutu dışlama sütununda yetersiz ayrım, proteinlerden iyi ayrılmayan sekiz ila dokuz dakika arasında bir parçacık zirvesiyle sonuçlanır. Burada, gürültü oranına karşı yetersiz bir sinyal vardır ve proteinlere bitişik geniş parçacıklar ışık saçılma sinyalinde belirgindir. İyi SEC-MALS sonuçlarının anahtarları uygun bir sütun seçerek sistemin düşük ışık saçılma gürültüsüyle kalibre edilmesini sağlamak ve parçacıkları kaldırmak için numuneleri önceden filtrelemek veya santrifüj etmektir.
SEC-MALS'den sonra protein örnekleri bağlayıcı afinite, biyoliza, yüzey plazmon rezonansı, izotermasyon kalorimetresi, biyolerid forometri, mikro ölçekli termoforez veya kompozisyon gradyan, çok açılı ışık saçılımı açısından daha fazla analiz edilebilir. Protein yapısı x-ışını kristalografisi, kriyo-elektron miskroskopisi veya NMR ile belirlenebilir.
