En este video, describimos un estudio modelo para el mecanismo de toxicidad amiloide a nivel de membrana utilizando mitocondrias cerebrales de rata como un modelo biológico in vitro. A pesar de acumular un informe que describe el mecanismo de perturbaciones de membrana por agregado amiloide en sistemas modelo de fosfolípidos estudiados directamente dirigidos a los eventos que comienzan en el desarrollo de la membrana biológica. En el presente video, describimos fibrillas amiloide de alfa-sinucleína analizando la membrana de las mitocondrias cerebrales de rata como un modelo biológico in vitro.
Creemos que las mitocondrias como orgánulo con membranas bien caracterizadas pueden proporcionar un sistema de modelos biológicos extremadamente útil para estudios moleculares relacionados con el mecanismo de citotoxicidad amiloide a nivel de membrana relacionada con enfermedades neurodegenerativas. Decapitar a la rata con una pequeña guillotina animal y eliminar el cerebro de la escala dentro de un minuto de la decapitación de la rata para limitar el posible deterioro de las propiedades mitocondriales. Es importante trabajar rápidamente y mantener todo sobre hielo durante todo el procedimiento.
Lave el tejido dos veces con 30 mililitros de tampón de aislamiento. Transfiera a un vaso de precipitados que contenga un amortiguador de aislamiento frío y picar finamente el cerebro con tijeras. Transfiera la suspensión tisular a un homogeneizador de douncia fría de 20 mililitros.
Homogeneizar las piezas de tejido usando nueve golpes hacia arriba y hacia abajo con un pestillo motorizado. Dejar la mezcla sobre hielo durante aproximadamente 30 segundos después de cada conjunto de tres golpes de homogeneización para asegurar que el homogeneización permanezca frío. Transfiera el homogeneato a un tubo centrífuga preenfriado y centrífuga a 1.300 G a cuatro centígrados durante tres minutos.
Decantar cuidadosamente el sobrenadante y transferirlo a un tubo de centrífuga pre-refrigerado. Centrífuga a 21.000 G a cuatro centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspúle el pellet en un medio de gradiente de densidad agitando suavemente la mezcla con la pipeta.
Centrífuga en un rotor de ángulo fijo a 30, 700 G a cuatro centígrados durante cinco minutos. Con una pipeta Pasteur, retire el extremo afilado del material acumulado en la parte superior, que en su mayoría contiene mielina. Agregue el tampón de aislamiento de ocho mililitros a la fracción mitocondrial mientras remueve suavemente la mezcla con la pipeta.
Centrífuga a 16.700 G a cuatro centígrados durante 10 minutos. Retire con cuidado el sobrenadante, dejando el pellet suelto de fondo sin perturbar. Añadir un mililitro 10 miligramos por mililitro de BSA sin ácidos grasos al tubo centrífugo mientras remueve suavemente la mezcla con la punta de la pipeta.
Ine a la base del volumen a cinco mililitros agregando búfer de aislamiento. Centrífuga a 6.900 G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Esto debería producir un pellet firme.
Decantar el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet mitocondrial en tampón de aislamiento. Diluir el homogeneato mitocondrial a un miligramo por mililitro con tampón de aislamiento frío y colocar en dos tubos de 1,5 mililitros, típicamente 195 microlitro de mitocondrias por tubo. Añadir cinco microlitrotro 20% de volumen por volumen Triton X-100 a un tubo como control positivo para la máxima actividad enzimática y cinco microlitor desionizado de agua a otro tubo para su control, seguido de la mezcla con un agitador.
Incubar los tubos durante 10 minutos en un baño de agua tibia a 30 grados centígrados. Mitocondrias de pellet por centrifugación de tubos en un rotor de ángulo fijo a 16.000 G cuatro centígrados durante 15 minutos. Recoja cuidadosamente los sobrenadantes resultantes para evaluar la actividad del malato deshidrogenasa mitocondrial utilizando un ensayo espectrofotométrico estándar descrito en la siguiente parte.
Calcule la integridad de la membrana mitocondrial de la siguiente manera. Para la determinación de la actividad de malato deshidrogenasa, pipetea 890 y 880 microlitros 50 mililolar Tris-HCL tampón a las cubetas de prueba en blanco y de muestra respectivamente seguidas de 100 microlitro 50 mililolares oxaloacetato y 10 microlitro de beta-NADH 10 milimétricas. Coloque las cubetas en un espectrofotómetro y haga referencia contra el espacio en blanco.
Añadir 10 microliter homogeneización mitocondrial un miligramo por mililitro para muestrear la cubeta. Mezclar inmediatamente por inversión. Registre la disminución de la absorbancia debido a la oxidación de NADH a 340 nanómetros durante un minuto.
Para la fibrilación amiloide alfa-sinucleína, agregue 294 microlitro de solución proteica, 200 micromolares a cada tubo de 1,5 mililitros. A continuación, agregue seis microlitr ThT solución un milimolar. Mezclar las soluciones e incubar los tubos en un termomezclador a 37 centígrados bajo agitación constante a 800 RPM.
Para la fibrilación amiloides de insulina bovina, agregue 637 microlitro de solución proteica, 250 micromolares a 1,5 mililitros de tubo. A continuación, añadir 13 microlitr ThT solución un milimolar seguido de agitación. Añadir alícuotas 200 microlitros de soluciones proteicas a cada pozo de una placa inferior clara de 96 pozos.
Selle la placa con cinta adhesiva cristalina. Cargue la placa en el lector de placas de fluorescencia Cytation 5. Mida la fluorescencia ThT a intervalos de 30 minutos durante 12 horas.
Utilice la excitación a 440 nanómetros y la emisión a 485 nanómetros. Seleccione los pozos. Agitar la placa durante cinco segundos antes de cada medición.
Ajuste la temperatura a 57 centígrados sin agitación. Preparar dos series de tubos de 1,5 mililitros que contengan homogeneados mitocondriales, una serie para ensayo de liberación de MDH y otra para la medición de ROS mitocondrial. Añadir alícuotas de fibrillas frescas o amiloideas de alfa-sinucleína, insulina bovina o lysozyme de huevo de gallina al homogenerato mitocondrial seguido de pipeteo suave.
Incubar tubos que contengan suspensiones mitocondriales durante 30 minutos en baño de agua tibia establecido en 30 grados centígrados. Para el ensayo de liberación de malato deshidrogenasa, centrífugo incubado homogeneizas mitocondriales a 16.000 G durante 15 minutos. Recoja cuidadosamente los sobrenadantes resultantes para el ensayo de la actividad de la MDH mitocondrial como se describe en la sección de protocolo parte cuatro.
Calcule la liberación de MDH de la siguiente manera. Para la medición de ROS mitocondrial, pipeta 191 microlitro de homogeneato mitocondrial incubado a cada pozo de una placa de 96 pozos. Añadir cuatro microlitrotro de 50 micromolares DCFDA.
A continuación, agregue cinco microlitros de succinato milimolar. Incubar el plato durante 30 minutos en un baño de agua tibia en 30 centígrados mientras se remueve suavemente. Cargue la placa en un lector de placas de fluorescencia Cytation 5 y mida la intensidad de la fluorescencia de acuerdo con la sección de protocolo.
La integridad de la membrana mitocondrial se evaluó midiendo la actividad de MDH en las mitocondrias aisladas antes y después de la interrupción de la membrana y la liberación de enzimas por Triton X-100. Como puede ver, típicamente encontramos que las preparaciones mitocondriales están alrededor del 93% intactas. Se llevó a cabo un ensayo de fluorescencia thT para monitorear el crecimiento de las fibrillas amiloideas.
La curva para la fibrilación amiloide de tres proteínas mostró un patrón sigmoidal típico, llegando a una meseta en aproximadamente 96, 12, y 96 horas para alfa-sinucleína, insulina bovina y lysozime de huevo de gallina respectivamente, lo que sugiere la formación de fibrillas amiloideas que fue más confirmada por la medición de AFM. La posible permeabilización y daño de la membrana mitocondrial por fibrillas amiloideas se investigó mediante la liberación de MDH mitocondrial y medición de ROS mitocondrial. Como se ve en el gráfico izquierdo, se observó una liberación sustancial de MDH tras la adición de las fibrillas amiloideas alfa-sinoucleína a las mitocondrias.
Mientras que una ligera liberación fue detectada por insulina fibrillas, se encontró que las fibrillas de lysozyme de clara de huevo de gallina eran ineficaces. El gráfico derecho muestra el efecto de las fibrillas amiloideas en el contenido de ROS mitocondrial. Si bien no se observó ninguna mejora significativa en el ROS mitocondrial al agregar la lisozima de la clara de huevo de gallina o las fibrillas amiloideas de insulina, el tratamiento con fibrillas de alfa-sinucleina condujo a un aumento considerable en el contenido de ROS de las mitocondrias cerebrales.
El presente vídeo describe un estudio modelo para el mecanismo de la citotoxicidad agregada del peroné a nivel de membrana, que demuestra cómo las fibrillas amiloideas derivadas de diversas proteínas pueden causar diferentes grados de daño de membrana y permeabilización. Mientras que algunos temas de fibrillas amiloideas y su membrana de unión específica parecen proporcionar la capacidad de interactuar con y causar desestabilización y perturbaciones posteriores de las membranas. Después de este video, usted será capaz de investigar la interacción de la forma nativa, pre-fibrilar, y fibrilla amiloide madura de diferentes péptidos y con mitocondrias aisladas de diferentes tejidos o varias áreas del cerebro.
