Este método puede ayudar a comprender las preguntas clave en el campo de interacción de célula a célula, como qué receptores median la adhesión o el reconocimiento en los contactos de célula a célula y si los ligandos específicos desencadenan sus interacciones. La principal ventaja de esta técnica es que permite investigar tales interacciones directamente en células vivas sin necesidad de fijación o interrupción celular. Aunque este método se utiliza para investigar las interacciones entre las células cultivadas, también se puede aplicar a otros sistemas de vesículas mono-membrana o incluso pequeños organismos modelo.
Generalmente, los individuos nuevos en este método deben comprobar que su muestra es lo suficientemente estable como para permitir la adquisición durante unos minutos inspeccionando cuidadosamente el movimiento de la célula y las variaciones lentas de la señal. En primer lugar, sembrar el número adecuado de células en al menos cuatro pocillos de una placa de seis pocillos al día antes de la transfección. Cultivo de las células a 37 grados Celsius 5%dióxido de carbono en el medio DMEM complementado con 10%FBS y 1%L-glutamina.
Realizar un experimento básico de plásmidos transfectos para la proteína de interés fusionado con una proteína fluorescente verde o amarilla y una proteína fluorescente roja en pozos separados. Después de cuatro horas retirar el medio de crecimiento y lavar cada pozo suavemente con un mililitro de PBS complementado con magnesio y calcio cayendo PBS en el borde del pozo para evitar el desprendimiento de las células durante el lavado. A continuación, quite el PBS.
Añadir aproximadamente 50 microlitros de solución EDTA gota sabia a cada pozo para facilitar el desprendimiento de las células. Después de incubar a 37 grados Celsius durante dos minutos, agitar lentamente la placa de seis pozos lateralmente para separar las células. A continuación, agregue 950 microlitros de medio de crecimiento a cada pozo y resuspendir las células pipeteando unas cuantas veces hacia arriba y hacia abajo, separando así todas las células del fondo del pozo.
Asegúrese de que las celdas se resuspenden correctamente y se desprendan unas de otras comprobando visualmente la ausencia de agregados de celdas grandes después de la resuspensión. Transfiera la solución celular de un pozo al pozo correspondiente. Mezclar suavemente pipeteando unas cuantas veces hacia arriba y hacia abajo.
Luego siembra las células mixtas en un plato inferior de vidrio de 35 milímetros y cultiva las células de las semillas a 37 grados Celsius en 5% dióxido de carbono durante un día. En el software de microscopio confocal de escaneo láser configurar la ruta óptica. Para evitar la interferencia espectral, seleccione dos pistas separadas para excitar y detectar mEGFP o mEYFP y mCherry o mCardinal secuencialmente y seleccione Cambiar pistas cada línea.
Para la detección utilice filtros adecuados para ambos canales. Coloque el plato que contiene las células mezcladas en el portacuchillas. Después de esperar 10 minutos para asegurar el equilibrio de temperatura y reducir la deriva de enfoque, concéntrese en las celdas utilizando la luz de transmisión en el menú Localizar.
Busque un par de celdas rojas y verdes en contacto entre sí. A continuación, seleccione una ruta de exploración perpendicular al contacto de celda a celda mediante el botón Recortar. Zoom para lograr un tamaño de píxel de 50 a 200 nanómetros y seleccione Línea en modo de escaneo.
Establezca el tamaño del fotograma en 128 por uno de los píxeles. Establezca la velocidad de escaneo en el valor máximo permitido. A continuación, establezca los ciclos en 100.000 a 500.000.
Después de esto, elija las potencias láser adecuadas. Establezca los detectores en el modo de recuento de fotones. Pulse Iniciar experimento para iniciar la adquisición.
Exporte los archivos de datos sin procesar a una imagen TIF RGB en formato de datos sin procesar. Este archivo contendrá un kymograph con los datos del canal verde y rojo en el canal llamado G y R de la imagen, respectivamente. A continuación, importe el archivo TIF con el software de análisis adecuado y proceda a realizar el análisis.
Alinee las líneas realizando un promedio de tiempo de segmento con bloques de 500 a 1000 líneas. Determinar la posición de la membrana en cada bloque. A continuación, cambie todos los bloques a la misma posición lateral.
Sume todas las líneas alineadas a lo largo del eje de tiempo y ajuste el perfil de intensidad media utilizando una función gaussiana. Defina los píxeles correspondientes a la membrana como todos los píxeles dentro de más o menos 2,5 sigma de la posición de la membrana, y sume la intensidad de estos píxeles en cada línea obteniendo un único valor de señal fluorescente para cada punto de tiempo. Si se observa blanqueo fotográfico, aplique una corrección de blanqueo ajustando la serie temporal de fluorescencia de membrana con una doble función exponencial y aplicando la fórmula de corrección adecuada.
Calcule las funciones de correlación automática y cruzada de acuerdo con las ecuaciones adecuadas. Para mejorar la fiabilidad del análisis y evitar artefactos, realice los cálculos de 10 a 20 segmentos iguales de la medición total. Inspeccione la serie temporal de fluorescencia y las funciones de correlación en cada segmento y elimine los segmentos claramente distorsionados.
Por último, promedia todos los segmentos no distorsionados. Al analizar los datos, inspeccione cuidadosamente las series temporales de intensidad y las funciones de correlación de cada segmento para evitar distorsiones, por ejemplo, debido a las vesículas intracelulares en la periferia de la membrana. Aquí se muestra una imagen de intensidad de las células HEK 293T que expresan myristolyated-palmitoylated-mEYFP o mCardinal.
Se observó una correlación cruzada relativa cercana a cero, mientras que las funciones de autocorrelación muestran tiempos de descomposición característicos de 10 a 20 milisegundos para la difusión de miristolyated-palmitoylated-mEYFP y mCardinal en la membrana plasmática. Las funciones de correlación cruzada de las mediciones sFCCS de células HEK 293T que expresaban heterodimermero anclado por membrana miristolyated-palmitoylated-mCardinal-mEYFP tenían amplitudes positivas y mostraban tiempos de descomposición similares a los de la función de autocorrelación. Las mediciones de sFCCS en contactos de célula a célula entre APLP1-mEYFP y APLP1-mCardinal-expressinging dio como resultado una correlación cruzada relativa positiva de 0,45.
Las funciones de correlación sFCCS obtenidas a partir de mediciones a través de clústeres APLP1 en contactos de células celulares mostraron una dinámica fuertemente reducida como evidente a partir de grandes tiempos de decaimiento en las oscilaciones en tiempos de retraso grandes. Tras la adición de iones de zinc, la correlación cruzada relativa aumentó a un valor promedio de 0,8. Además, el brillo molecular aumentó significativamente de pequeños oligómeros a multimers más grandes que consisten en 10 a 50 monómeros en cada célula.
Las inestabilidades transitorias pueden dar lugar a una función de correlación cruzada que tenga valores negativos o una alta correlación cruzada falsa positiva. Las funciones de correlación correspondientes normalmente se desvían fuertemente de las de la mayoría de los segmentos. Como un enfoque complementario al número de correlación cruzada sFCCS y el brillo se puede utilizar para detectar interacciones proteína-proteína.
Al intentar este procedimiento es importante recordar que la mezcla de células trans infectadas es un paso crítico. Mezcle suavemente las células y optimice la eficiencia de la transfección para aumentar la posibilidad de encontrar células rojas y verdes en contacto. Después de su desarrollo esta técnica ha sido utilizada por investigadores en el campo de la inmunología para explorar las interacciones de las moléculas de señalización en las sinapsis inmunológicas.
