Este protocolo describe cómo se pueden utilizar las larvas transgénicas de peces cebra para proporcionar un ensayo cuantitativo in vivo de la vascularización del xenoinjerto tumoral. La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas anteriores es que permite al investigador cuantificar con precisión los cambios en los niveles de vascularización del xenoinjerto. El paso clave es asegurar que las células tumorales se inyectan correctamente en larvas de pez cebra para que los pasos posteriores de diagnóstico por imágenes y cuantificación no se vean comprometidos.
Después de cultivar y etiquetar células B16-F1 con tinte fluorescente, comience a preparar embriones para la implantación. Llene un plato de 35 milímetros con una solución de 2% metilcelulosa en E3 a una cuarta parte del volumen del plato. Con una pipeta de transferencia, coloque aproximadamente 50 embriones transgénicos previamente preparados en la metilcelulosa mientras minimiza el volumen de la solución E3 transferida.
Usando una punta de pipeta microcapillar, organizar los embriones de modo que todos estén orientados verticalmente con la cabeza hacia arriba, colas hacia abajo, y el embrión con su lado izquierdo hacia arriba. Agregue 50%ECM a un pellet de célula B16-F1 previamente preparado para producir una mezcla de células a ECM en una proporción de dos a uno. Mezclar bien pipeteando y revolviendo, y almacenar la mezcla en hielo.
Utilice una pipeta microcapillar para tomar hasta tres a 10 microlitros de células. Inserte cuidadosamente la punta de la pipeta en una aguja de microinyección previamente preparada y luego expulse la mezcla de matriz B16-F1 en el extremo de la aguja. Inserte la aguja en el soporte de la aguja e incline en un ángulo de 45 grados con respecto al plato.
Use pinzas para romper la punta de la aguja para hacer un agujero lo suficientemente grande como para que las células sean expulsadas de la aguja sin apretar las células. Encienda el cilindro de aire presurizado conectado al aparato de inyección y, a continuación, encienda momentáneamente el inyector en modo continuo durante no más de un segundo para empujar las células a la punta de la aguja. Apunte la aguja hacia el saco de yema de un embrión, y empújela a través del saco de yema en una dirección ventral hasta que la punta de la aguja haya emergido del saco de la yema y esté empujando la epidermis embrionaria en el lado ventral del embrión, sólo posterior al corazón.
Empuje cuidadosamente y ligeramente la punta de la aguja hacia adelante hasta que haya creado un pequeño espacio entre la epidermis y la membrana del saco de yema. Pulse el inyector para expulsar parte de la mezcla celular en este espacio de perivitellina. Observe cuidadosamente el tamaño, la forma y la ubicación del xenoinjerto a medida que se está implantando, y ajuste el número de pulso y la posición de la aguja en consecuencia para asegurar un xenoinjerto correctamente implantado.
Repita los pulsos hasta que se hayan inyectado entre 500 y 800 células en el espacio de la perivitellina, creando una protuberancia visible que se extiende al menos la mitad del camino a lo largo de la parte inferior del saco de yema. Retire la aguja del embrión. Después de inyectar todos los embriones, utilice una punta de pipeta microcapilar para empujar todos los embriones juntos para que puedan ser pipetados con la menor metilcelulosa posible.
Transfiera los embriones a un plato de recuperación que contenga E3 con PTU y azul de metileno. A continuación, pipetee suavemente E3 alrededor de los embriones para lavarlos, y luego incubar a 34 grados centígrados. A continuación, imagine embriones anestesiados utilizando un microscopio confocal.
Utilice un canal láser adecuado para que las células tumorales determinen un volumen a tomar imágenes, lo que permite al menos una o dos secciones ópticas a ambos lados del injerto. Utilice intervalos de sección que estén separados por unos cinco micrómetros para crear una pila Z. Utilice imágenes de dos canales para tomar imágenes tanto de los vasos sanguíneos como del xenoinjerto tumoral.
Imagen del xenoinjerto tumoral y los vasos sanguíneos de una larva, y repita estos pasos para cada larva a tomar imágenes. Para comenzar con la cuantificación de la respuesta angiogénica al xenoinjerto de pez cebra, transfiera los archivos de imagen confocal de pila Z creados previamente de un xenoinjerto tumoral a una nueva carpeta en el software de análisis de imágenes 3D. Para crear el protocolo de volumen tumoral para medir el volumen de xenoinjerto tumoral, vaya a la pestaña Medición en el menú superior de la ventana y, a continuación, desde la lista de protocolos que aparece, arrastre el protocolo denominado Buscar objetos al espacio que se titula Arrastrar tareas aquí para realizar mediciones.
Después de asegurarse de que este protocolo está configurado para medir objetos en el canal tumoral, arrastre los protocolos denominados Clip To ROIs y Make ROI From Population desde la lista de protocolos hasta el espacio Drag Tasks Here To Make Measurements, asegurándose de que estos dos comandos se aplican a los objetos identificados por Buscar objetos. Antes de calibrar la configuración de este protocolo, vaya al menú desplegable situado encima de la etiqueta Modo en la parte superior izquierda de la ventana y seleccione la vista Enfoque extendido. Anule la selección de los canales no tumorales en el panel del extremo derecho haciendo clic en el círculo negro debajo de cada encabezado del canal para que solo se pueda ver el canal tumoral.
A continuación, utilice la herramienta Mano alzada en la parte superior de la ventana para dibujar una región de interés, o ROI, alrededor de todo el volumen del tumor. En el panel debajo de la imagen, seleccione la etiqueta Resumen y, a continuación, establezca la opción Mostrar para mostrar la población dos. Para calibrar, en la tarea Buscar objetos, haga clic en el asterisco para abrir la ventana de configuración.
Ajuste el umbral utilizando la intensidad y determine el umbral inferior hasta que solo se seleccionen las células tumorales y no la fluorescencia de fondo. Determine el tamaño mínimo del objeto para que solo se miden las celdas intactas, a diferencia de los elementos más pequeños de los desechos de celda, estableciendo el tamaño mínimo del objeto como 100 micrómetros cúbicos. Guarde este protocolo como Volumen de tumor haciendo clic en la pestaña Mediciones del menú superior y haciendo clic en Guardar protocolo.
Utilice los mismos ajustes para medir todos los xenoinjertos. Para medir el volumen de los vasos sanguíneos asociados al xenoinjerto, cree un nuevo protocolo yendo al menú superior y luego haciendo clic en la pestaña Dimensiones y luego en Protocolo claro. Arrastre las tareas Buscar objetos y Recortar a ROI al espacio que se titula Arrastrar tareas aquí para realizar mediciones para este protocolo.
Asegúrese de que el primer comando está configurado para medir objetos en el canal del vaso sanguíneo y que el siguiente comando está configurado para aplicarse a los objetos identificados por el primer comando. A continuación, anule la selección de los canales que no son vasos en el panel del extremo derecho para que solo se puedan ver los vasos sanguíneos. Determine la configuración del protocolo de volumen de recipiente de una manera similar a la del protocolo de volumen tumoral descrito anteriormente y guarde este protocolo como volumen de recipiente.
Borre el protocolo y dibuje un ROI alrededor del xenoinjerto, teniendo cuidado de no incluir ninguna autofluorescencia no tumoral. Para medir la suma del volumen de los objetos del canal tumoral dentro de este ROI, haga clic en la pestaña Dimensiones, seleccione el comando Restaurar protocolo, elija el protocolo Volumen de tumor y haga clic en Restaurar. Con el nuevo ROI realizado por el protocolo Tumor Volume, haga clic en la pestaña Dimensiones y seleccione el comando Restaurar protocolo, elija el protocolo De volume de la embarcación y haga clic en la fila de suma para calcular el volumen total de objetos en el canal del buque dentro de este ROI.
Divida el volumen del vaso por el volumen del tumor y multiplique la respuesta por 100 para obtener un valor porcentual de la vascularización del injerto. Mediante la toma de imágenes de un xenoinjerto individual a las seis, 24 y 48 horas después de la implantación, se puede calcular la respuesta angiogénica en diferentes puntos de tiempo, con la mayor respuesta angiogénica entre 24 y 48 horas después de la implantación y los niveles máximos de vascularización del injerto observados alrededor de 48 horas. Las imágenes de lapso de tiempo confocales de un xenoinjerto B16-F1 implantados en un embrión de pez cebra después de la fertilización de dos días muestran que los vasos sanguíneos etiquetados por GFP crecen a través del xenoinjerto, formando una red de torsión con vasos de tamaño irregular y morfología típicos de la red vascular anormal observada en tumores de mamíferos.
Los xenoinjertos incubados en el inhibidor VEGFR muestran una gran reducción del vaso en comparación con los xenoinjertos de control incubados en DMSO. En los embriones de control, hubo una red vascular expansiva que se extendió por toda la región del xenoinjerto, la respuesta angiogénica típica observada después de la implantación de células B16-F1. Cuando se cuantifica, la respuesta angiogénica muestra una clara reducción de la vascularización del injerto en los xenoinjertos tratados con inhibidores VEGFR en comparación con los controles.
El canal tumoral muestra una masa de células B16-F1 etiquetadas fluorescentemente debajo del saco de yema, que muestra autofluorescencia. Por lo tanto, un ROI debe ser cuidadosamente dibujado alrededor del xenoinjerto, teniendo cuidado de no incluir ninguna de las autofluorescencias del saco de yema. El protocolo tumoral identificó todas las celdas B16-F1 en el ROI, midió su volumen y recortó el ROI a su volumen.
El protocolo de volumen de recipientes tumorales en este nuevo ROI recortado permitió la identificación de todos los recipientes asociados con la masa de células B16-F1 y midió su volumen. Los valores de los protocolos Volumen tumoral y Volumen de vasos tumorales se pueden utilizar para dar una medida de la vascularización del injerto. La capacidad de contabilidad genética y la permeabilidad del pez cebra permiten la investigación de vías de alta señalización en la angiogénesis tumoral, y también puede actuar como una plataforma de cribado para identificar compuestos anti-angiogénicos.
