El análisis de huella es una alternativa de bajo costo para digitalizar programas de análisis de marcha para investigadores que cuantifican las anomalías del movimiento en ratones. Debido a su velocidad, simplicidad y potencial longitudinal, este método es ideal para el fenotipado conductual de modelos de ratón incluyendo modelos de enfermedad neurodegenerativa, enfermedad neuromuscular o accidente cerebrovascular. Demostrando el procedimiento estará Virginia Wertman, una técnica de investigación de mi laboratorio.
Antes de comenzar el experimento, aclimate a los ratones que han estado completamente despiertos y alerta durante al menos cinco minutos hasta la sala de ensayo durante 30 minutos. Coloque el túnel sobre una tira de papel ligeramente más ancha y más larga que la longitud y la anchura del túnel. Marque el papel con el ID del ratón y la fecha de prueba.
Agregue las semillas de girasol a la cámara de meta para la motivación según sea necesario y desenfado firmemente el primer ratón que se va a probar. Usando puntas de pincel cónico de aproximadamente 0,5 centímetros de diámetro, pinte toda la parte inferior de todos los dedos de los dedos y el centro de cada pieza delantera con un color de pintura a base de agua lavable no tóxico. Recubrir las patas traseras con un color de pintura a base de agua lavable no tóxico en contraste de una manera similar.
Utilice un paño limpio y húmedo para eliminar cualquier pintura que el ratón tenga en otras partes de su cuerpo para evitar manchas que puedan interferir con la recopilación de datos. A continuación, coloque el ratón al principio del túnel. Deje que el ratón camine hasta la cámara antes de recuperar al animal para limpiar suavemente sus pies con un paño humedecido con agua.
A continuación, vuelva a colocar el ratón en su jaula de origen y limpie el área de prueba y el túnel con un desinfectante antes de probar el siguiente animal. Para obtener una puntuación precisa, permita que las huellas se sequen por completo antes de seleccionar pasos que estén espaciados constantemente con huellas claras sin manchas. Para generar suficientes datos de puntuación, debe haber al menos dos pasos consecutivos de cada pie.
No incluya la primera y la última huella en el papel, ya que es poco probable que representen una marcha normal porque el ratón estaba cambiando su velocidad de marcha. Para definir la longitud de zancada como la distancia entre dos huellas secuenciales creadas por el mismo pie, utilice un lápiz para dibujar un círculo de dos a cuatro milímetros alrededor de la región del antepié de ambas huellas de la extremidad delantera en una sola zancada y utilice una regla para dibujar una línea entre los círculos. Registre la distancia entre dos impresiones desde el centro de cada círculo como la parte delantera derecha o la delantera izquierda, según corresponda y repita la medición para cada uno de los pasos que se pueden puntuar.
A continuación, promediar todas las distancias de zancada registradas individuales para cada extremidad promediando las puntuaciones individuales dentro de una cohorte juntas según sea experimentalmente apropiada. Para definir la anchura de la zancada como la distancia entre las extremidades delanteras izquierda y derecha o las extremidades posteriores, dibuje y mida una línea desde la región del antepié con círculo de una extremidad posterior que se interseque perpendicularmente con la línea para la longitud de la zancada en la extremidad posterior contralateral. Repita esta medición para todas las impresiones de las extremidades posteriores que se pueden puntuar y promediar las mediciones.
Para definir la extensión del dedo del pie como la distancia entre el primer y el último dedo del pie en una sola huella de los pies o de la extremidad posterior, utilice pinzas para medir la distancia entre la punta de la primera impresión del dedo del pie y la punta de la última impresión del dedo del pie. A continuación, repita la medición para todas las impresiones de las extremidades posteriores que se pueden puntuar y promediar las mediciones. Con un número suficiente de animales, este procedimiento es capaz de detectar las diferencias de marcha entre genotipos de ratón dentro de la misma cepa con el tiempo.
Por ejemplo, aquí se muestran rastros representativos de imágenes de huella recopiladas utilizando un modelo de ratón de atrofia muscular espinal y bulbar ligada al x, un trastorno neurodegenerativo que afecta a las neuronas motoras inferiores y al músculo esquelético. El análisis gait de ratones macho transgénicos presintomáticos y post-sintomáticos transgénicos y de control de la basura muestran que antes de la aparición de la enfermedad, los ratones transgénicos muestran una longitud de zancada similar, anchura de zancada y propagación de los dedos del pie en comparación con sus controles no transgénicos de mate de basura. Sin embargo, después de la aparición de la enfermedad, los animales transgénicos presentan longitudes de zancada significativamente más cortas.
Un análisis longitudinal similar no reveló diferencias en el ancho de zancada a ninguna de las edades probadas. Los ratones transgénicos post-sintomáticos también tienen una diseminación del dedo del pie trasero significativamente más estrecha que los controles de la pareja de basura coincidente con la edad. Una correcta aplicación de la pintura a las patas dará los mejores resultados.
Recuerde que solo se deben puntuar los pasos que estén espaciados constantemente con huellas claras no manchadas. Esta técnica es lo suficientemente sensible como para detectar cambios menores en la zancada. Y debido a su enfoque no invasivo, permite realizar pruebas de grupos a lo largo de su vida útil presentación fenotípica e intervenciones terapéuticas.
