Estamos presentando patología de expansión, o ExPath para abreviar, una medida de bajo costo para imaginar biomolécula de interés en las secciones estándar de tejido clínico, con precisión a nanoescala. ExPath elude el límite de difracción de la microscopía de luz convencional al infundir químicamente la sección del tejido clínico con un hidrogel inflamable del agua, y luego expandir física y uniformemente las muestras tratadas en alrededor de cien veces, permitiendo que las biomoléculas previamente superpuestas se separen y observen con un microscopio óptico convencional. ExPath permite a los usuarios estudiar configuraciones a nanoescala de biomoléculas relacionadas con enfermedades en muestras de tejido, sin necesidad de invertir en nuevo hardware de imágenes.
Por lo tanto, permitiendo nuevos conocimientos de la enfermedad y fomentando un nuevo diagnóstico. Este método se puede aplicar a una amplia gama de tipos de tejido y se puede utilizar para proporcionar una nueva visión de la patogénesis de varias enfermedades complejas, como el cáncer, enfermedad cerebral, enfermedad autoinmune, y otros. La demostración visual es importante para ilustrar cómo hacer los pasos críticos correctamente, como la construcción de la cámara de geling y el manejo de la muestra gelificada antes y después de la digestión de Proteinase K.
Comience convirtiendo el tejido de interés en un formato compatible con ExPath. Si trabaja con muestras clínicas FFPE, coloque la diapositiva con la muestra en un tubo cónico de 50 ml y agregue 15 ml de Zylene. Tapa el tubo y colócalo horizontalmente sobre un agitador orbital aproximadamente a las 60 rpm durante tres minutos.
Repita el lavado con otros 15 ml de Zylene. A continuación, lave la diapositiva en una serie de diluciones de etanol, de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Si trabaja con diapositivas permanentes manchadas y montadas, coloque cada diapositiva en un tubo cónico de 50 ml y, a continuación, cúbrala con Zylene.
Retire con cuidado el resbalón de la cubierta con una cuchilla de afeitar. A continuación, procese la diapositiva de la misma manera que las muestras clínicas FFPE. Si trabaja con diapositivas de tejido congelado sin fijar en solución OCT, fije el tejido en acetona a 20 grados Celsius durante diez minutos y, a continuación, lave las muestras con 1X de solución PBS tres veces durante diez minutos por lavado.
Si procesa muestras clínicas previamente fijas y congeladas, deje los portaobjetos durante dos minutos a temperatura ambiente para derretir la solución OTC y, a continuación, lave la muestra con 1X PBS tres veces, durante cinco minutos por lavado. Después de la conversión de formato, realice la recuperación de antígenos en todas las muestras. Caliente la solución de citrato de 20 milimolares a 100 grados centígrados en un microondas y coloque el portaobjetos en la solución.
Transfiera inmediatamente el recipiente a una cámara de incubación e i incubarlo a 60 grados centígrados durante treinta minutos. Para manchar la muestra, utilice una pluma hidrófoba para dibujar un límite alrededor de la sección de tejido en la diapositiva. Coloque el portaobjetos en una placa de petri, luego incuba el tejido con tampón de bloqueo durante una hora a 30 grados Centígrados.
Luego, incubar los tejidos con la solución primaria de anticuerpos durante al menos tres horas a temperatura ambiente o 37 grados celsius. Después de la incubación, lave el tejido tres veces con tampón de bloqueo e iclerelo en solución secundaria de anticuerpos durante al menos una hora a temperatura ambiente, o 37 grados centígrados. Repita los lavados con el búfer de bloqueo y, a continuación, realice imágenes fluorescentes, utilizando un microscopio convencional de campo ancho u otro sistema de imágenes de su elección.
Preparar la solución de anclaje de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Coloque los portaobjetos en un plato de petri de 100 ml, entucle la solución de anclaje sobre el tejido e in incubarlos durante al menos tres horas a temperatura ambiente. A continuación, prepare la solución gelificante de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Retire el exceso de solución de anclaje de la sección de tejido y vuelva a colocar la diapositiva en la placa de petri. Añadir solución gelificante fría fresca a la muestra e incubar la mezcla durante treinta minutos, a cuatro grados centígrados. Para construir una cámara en el tobogán alrededor de la muestra, cree espaciadores cortando trozos de vidrio de cubierta con un cuchillo de diamante.
Asegure los espaciadores a cada lado del tejido con agua y coloque cuidadosamente una tapa de tapa sobre el portaobjetos, asegurándose de evitar atrapar burbujas de aire sobre el tejido. Luego, incubar la muestra a 37 grados centígrados en un ambiente humidificado durante dos horas. Retire la tapa de la cámara de geling deslizando suavemente una cuchilla de afeitar debajo del cubreobjetos y levantándola lentamente de la superficie del gel.
Recorte el gel en blanco alrededor del tejido para minimizar el volumen, asegurándose de cortar el gel de forma asimétrica para realizar un seguimiento de la orientación. Diluir Proteinase K de uno a doscientos en tampón de digestión, asegurándose de preparar la solución suficiente para sumergir completamente el gel. A continuación, incubar la muestra con la solución en un recipiente cerrado durante tres horas a 60 grados centígrados.
Si la muestra no se desprende durante la digestión, utilice una cuchilla de afeitar para extraerla suavemente. Utilice un pincel suave para transferir la muestra a 1X PBS en un recipiente compatible con el sistema de imágenes deseado y lo suficientemente grande como para acomodar el gel completamente expandido. Lavar la muestra en PBS durante diez minutos y si lo desea descansar con 300 DAPI mililolares.
Expanda las muestras lavando la muestra con un volumen excesivo de agua destilada doble de tres a cinco veces durante diez minutos por lavado. A continuación, realice imágenes de fluorescencia. Si este protocolo se realiza con éxito, las muestras aparecen como un gel plano y transparente después de la homogeneización mecánica y pueden expandirse por un factor de 3 a 4,5 en agua.
Una muestra renal FFPE de cinco micrómetros de espesor se amplió 4,5 veces, lo que resultó en una resolución de 63 nanómetros utilizando un objetivo de 0,95 NA. El tejido se convirtió entonces en un formato compatible con la patología de expansión y se tiñeba de anticuerpos para Alpha Actinin 4 y Vimentin, DAPI para visualizar el ADN nuclear, y Wheat Germa Glutenin para etiquetar carbohidratos. A continuación, se utilizó una microscopía confocal de disco giratorio para crear imágenes de la muestra.
El tejido renal se expandió por completo en agua y se volvió a imaginar. El agrietamiento, las distorsiones y la pérdida de objetivos etiquetados pueden ser el resultado de un anclaje o homogeneización inadecuados. La hematoxilina y la eosina mancharon el tejido mamario normal se trataron como una muestra de FFPE, se expandió, se etiquetó con DAPI y se tomó una imagen en un microscopio confocal de disco giratorio.
Las rodajas de riñón no fijadas y congeladas también se procesaron utilizando este protocolo. El tejido se fijó en acetona fría y se tiñe con Alfa Actinin 4, Vimentin, DAPI, y Wheat Germa Glutenin. Al realizar esta técnica, es importante recordar que el momento del paso de gelación es crítico.
La geleración prematura puede causar distorsiones, limitar la expansión y provocar la pérdida de moléculas diana. Después de este procedimiento, se pueden realizar imágenes fluorescentes en un microscopio después de la digestión y expansión de la muestra. ExPath se puede aplicar ampliamente tanto en patologías como más allá.
Como permite a los investigadores visualizar detalles sutiles en las muestras de tejido de interés. Por lo tanto, puede ayudar a los investigadores a obtener nuevos conocimientos sobre la patogénesis de enfermedades o mecanismos de procesos biológicos.
