Este método de hibridación de microarray es útil para comparar un gran número de muestras de un organismo con un genoma conocido. En comparación con un enfoque de secuenciación de alto rendimiento, la cantidad de datos generados por este método es mucho más fácil de manejar y, además, se puede analizar de una manera más rentable. Demostrando el procedimiento será el Dr. Christiane Seiler un científico post-doctoral que trabaja en el grupo de investigación en Rosis en el IPK en Gatersleben.
Antes de realizar la hibridación de microarray con el kit de hibridación de expresión génica, prepare el agente de bloqueo 10X de acuerdo con las especificaciones del fabricante y aliquot el agente bloqueador resultante en volúmenes de 200 microlitros. A continuación, guarde el agente de bloqueo a menos 20 grados Centígrados hasta su uso. El día de la hibridación de microarray, descongele una alícuota de 200 microlitros del agente bloqueador 10X en hielo y precalifique el horno de hibridación a 65 grados Celsius y un bloque de calor a 60 grados Celsius.
Prepare la mezcla de fragmentación para cada muestra según lo descrito por el fabricante y mezcle las muestras suavemente en un vórtice. Después del vórtice, gire brevemente las muestras en una microcentrífuga antes de incubar durante exactamente 30 minutos en el bloque de calor de 60 grados Celsius. Al final de la incubación, enfríe inmediatamente cada tubo sobre hielo durante un minuto antes de detener la fragmentación con 25 microlitros de tampón de hibridación de expresión génica 2X, altas revoluciones por minuto por tubo.
Mezclar con pipeteo suave, teniendo mucho cuidado de no introducir ninguna burbuja, y centrifugar los tubos a temperatura ambiente ambiente. Al final del giro coloque inmediatamente todos los tubos sobre hielo y cargue cada muestra en la diapositiva de microarray lo más rápido posible. A continuación, dispensar lentamente 44 microlitros de cada hibridación se mezclan en el centro de cada junta bien, teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas, y añadir 44 microlitros de tampón de hibridación en cualquier pozo no utilizado.
Coloque inmediatamente la corredera de microarray en la orientación correcta en la parte superior de la corredera de la junta, teniendo cuidado de no derramar ningún líquido y cierre firmemente el conjunto de hibridación. Gire el conjunto para confirmar la falta de burbujas de aire estacionarias y coloque el conjunto de la cámara de hibridación en el rotador del horno de hibridación. Establezca la velocidad de rotación en 10 revoluciones por minuto, luego inicie la hibridación a 65 grados centígrados durante exactamente 17 horas.
Mientras las muestras se hibridan, prepare tres conjuntos de platos de lavado en los búferes de lavado apropiados, tal como se describe en las tablas. Después de exactamente 17 horas de hibridación, desmonte una cámara de hibridación en un banco de laboratorio forrado con papel libre de pelusas y transfiera un sándwich de microarray a un plato que contenga un búfer de lavado uno con el código de barras de microarray mirando hacia arriba en una posición inclinada sin sumergir toda la diapositiva en el búfer. Usando fórceps, separe los dos portaobjetos de vidrio y deje que la junta se deslice suavemente en la parte inferior del plato mientras mantiene un agarre firme en el portaobjetos de microarray.
Levante lentamente el portaobjetos de microarray hacia los lados para su transferencia inmediata al bastidor de microarray en el plato dos con una exposición mínima al aire. Cuando las ocho diapositivas se hayan colocado uniformemente a lo largo del bastidor, conecte el soporte del bastidor y transfiera toda la configuración del plato a la rueda magnética. Revuelva la configuración suavemente durante exactamente un minuto.
Mientras las muestras se agitan, transfiera el plato tres de la incubadora Celsius de 37 grados a un segundo agitador magnético. A continuación, agregue suavemente 37 grados Celsius tampón de lavado dos para plato tres sin formar burbujas. Al final de la incubación de agitación, transfiera suavemente y lentamente el portaobjetos al plato tres y retire el soporte del portaequipajes.
Después de agitar durante exactamente un minuto, retire lentamente y suavemente el portaobjetos del plato y use papel libre de pelusas para secar cuidadosamente ambos lados de cada diapositiva, colocando cada diapositiva en una caja deslizante a medida que se seca. Después de permitir que las diapositivas se sequen durante 15 minutos, transfiera cada diapositiva de microarray a un portaobjetos con el código de barras hacia arriba y cargue los portaobjetos montados en un carrusel de escaneo y una secuencia de acuerdo con el número de código de barras. A continuación, escanee inmediatamente las diapositivas.
En esta figura, se muestra un resultado representativo de una ejecución para probar la calidad de la extracción de ARN. En los análisis típicos de muestras de bajo contenido de almidón, como hojas de cebada, son evidentes bandas adicionales de ARN ribosomal de cloroplastos. Las muestras de alto contenido de almidón, como las semillas de cebada, exhiben ARN ribosomal 18 y 28S.
Tenga en cuenta que no se puede calcular ningún valor automatizado del número de integridad del ARN para los tejidos vegetales verdes, como las muestras de hojas, debido al ARN ribosomal de cloroplasto. En este análisis representativo, se realizó una preparación de ARN e hibridación a un chip de microarray de cebada personalizado como se demostró. La cuadrícula muestra un ejemplo de señales derivadas de cada esquina del chip, incluyendo el fondo y el pico en los puntos de lectura utilizados para la calibración.
El histograma indica la desviación de puntos detectables con las respectivas intensidades de señal. Como se observó, una hibridación exitosa da una amplia curva en forma gaussiana con sólo valores atípicos menores. Aquí se muestra el informe de control de calidad para las señales detectadas.
Los valores de la diapositiva hibrida se indican en la columna dos y el intervalo de valores aceptables se muestra en la columna cuatro. Este método se puede utilizar para abordar cualquier configuración experimental para cualquier organismo en el que se disponga de información sustancial sobre el genoma. El uso de esta técnica en nuestro laboratorio nos permitió comparar y analizar los cambios transcriptómicos en el arroz y la cebada que se producen después de la inducción del estrés de crecimiento.
