이 마이크로어레이 혼성화 방법은 알려진 게놈과 유기체로부터 많은 수의 샘플을 비교하는 데 유용합니다. 높은 처리량 시퀀싱 접근 방식에 비해, 이 방법에 의해 생성된 데이터의 양은 훨씬 더 쉽게 처리되고, 더 비용 효율적인 방법으로 분석될 수 있다. 절차를 시연하는 것은 게이틀벤의 IPK에서 로지스의 연구 그룹에서 일하는 박사 후 과학자 인 크리스티안 세일러 박사가 될 것입니다.
유전자 발현 혼성화 키트를 사용하여 마이크로어레이 혼성화를 수행하기 전에 제조업체의 사양에 따라 10X 차단제를 준비하고 200 마이크로리터 부피를 통해 결과 차단제를 알리쿼트한다. 그런 다음 차단제를 사용 전까지 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. 마이크로어레이 혼성화 당일, 얼음에 10X 차단제의 200 마이크로리터 알리쿼트 1개를 해동하고 혼성화 오븐을 섭씨 65도, 열블록을 섭씨 60도로 예열한다.
제조업체에서 설명한 대로 각 샘플에 대한 조각화 믹스를 준비하고 샘플을 소용돌이에 부드럽게 혼합합니다. 소용돌이 후, 잠시 60섭씨 열 블록에서 정확히 30 분 동안 배양하기 전에 미세 원심 분리기에서 샘플을 아래로 회전합니다. 인큐베이션의 끝에서, 즉시 2X 유전자 발현 혼성화 버퍼의 25 마이크로 리터로 단편화를 중지하기 전에 얼음에 각 튜브를 냉각, 튜브 당 분당 높은 회전.
부드러운 파이펫팅과 섞어 거품을 소개하지 않도록 세심한 주의를 기울이고, 주변 실온에서 튜브를 원심분리합니다. 스핀이 끝나면 모든 튜브를 얼음에 즉시 놓고 각 샘플을 가능한 한 빨리 마이크로어레이 슬라이드에 로드합니다. 다음으로 각 혼성화 믹스의 44마이크로리터를 각 개스킷중앙에 천천히 분배하여 거품을 유입하지 않도록 주의하고, 사용하지 않은 유정에 44마이크로리터의 하이브리드화 버퍼를 추가합니다.
즉시 마이크로어레이 슬라이드를 개스킷 슬라이드 위에 올바른 방향으로 배치하여 액체를 흘리지 않도록 주의하고 혼성화 조립을 단단히 닫습니다. 어셈블리를 회전하여 고정기기의 부족을 확인하고 혼성화 챔버 어셈블리를 혼성화 오븐 회전기로 배치합니다. 회전 속도를 분당 10회전으로 설정한 다음 정확히 17시간 동안 섭씨 65도에서 혼성화를 시작합니다.
샘플이 혼성화되는 동안 테이블에 설명된 대로 적절한 세척 버퍼에 세 개의 세척 접시 어셈블리를 준비합니다. 정확히 17시간 동안 혼성화한 후, 보풀 프리 페이퍼가 늘어선 실험실 벤치에 하나의 하이브리드화 챔버를 분해하고 완충제의 전체 슬라이드를 잠크지 않고 비스듬히 기울어진 위치에 마이크로어레이 바코드가 있는 세척 버퍼 1개를 함유한 접시에 마이크로어레이 샌드위치 1개를 전달합니다. 집게를 사용하여 두 개의 유리 슬라이드를 분리하고 개스킷 슬라이드가 접시 바닥에 부드럽게 떨어지면서 마이크로 어레이 슬라이드에 단단히 그립을 유지합니다.
마이크로어레이 슬라이드를 옆으로 천천히 들어 올려 공기에 최소한의 노출로 2접시의 마이크로어레이 랙으로 즉시 이동합니다. 8개의 슬라이드가 랙을 따라 고르게 배치되면 랙 홀더를 부착하고 전체 접시 2개의 설정을 자기 교반기로 옮길 수 있습니다. 정확히 1분 동안 설정을 부드럽게 저어줍니다.
시료가 교반되는 동안, 37도 섭씨 인큐베이터에서 제2자교교로 접시 3편을 옮겨줍니다. 그런 다음 거품을 형성하지 않고 3 접시에 37도 세척 버퍼 2를 부드럽게 추가합니다. 교반 인큐베이션이 끝나면 슬라이드 랙을 부드럽게 천천히 옮기고 3접시에 넣고 랙 홀더를 제거합니다.
정확히 1 분 동안 저은 후, 천천히 부드럽게 접시에서 슬라이드 랙을 제거하고 조심스럽게 각 슬라이드의 양쪽을 건조, 건조로 슬라이드 상자에 각 슬라이드를 배치 보풀 무료 종이를 사용합니다. 슬라이드가 15분 동안 건조할 수 있도록 허용한 후 각 마이크로어레이 슬라이드를 슬라이드 홀더로 옮기고 바코드가 켜진 바코드 에 따라 조립된 슬라이드 홀더를 스캔 슬라이드 및 시퀀스로 로드합니다. 그런 다음 슬라이드를 즉시 스캔합니다.
이 그림에서, RNA 추출의 품질을 테스트하기 위한 실행으로부터의 대표적인 결과가 나타난다. 보리 잎과 같은 낮은 전분 함량 샘플의 전형적인 분석에서 엽록소에서 추가 리보소말 RNA 밴드가 분명합니다. 보리 씨와 같은 높은 전분 함량 샘플은 18 및 28S 리보소말 RNA를 전시합니다.
엽록소 리보소말 RNA로 인해 잎 샘플과 같은 녹색 식물 조직에 대해 자동화된 RNA 무결성 번호 값을 계산할 수 없습니다. 본 대표적인 분석에서, 맞춤형 보리 마이크로어레이 칩에 대한 RNA 제제 및 혼성화가 입증된 바와 같이 수행되었다. 그리드는 보정에 사용되는 판독 점의 배경 및 스파이크를 포함하여 칩의 각 모서리에서 파생된 신호의 예를 보여 주며 있습니다.
히스토그램은 각각의 신호 강도가 있는 검출 가능한 점의 편차를 나타냅니다. 관찰된 바와 같이, 성공적인 혼성화는 사소한 이상치만으로 광범위한 가우시안 모양의 곡선을 제공합니다. 여기에 검출된 신호에 대한 품질 관리 보고서가 표시됩니다.
혼성 슬라이드의 값은 열 2에 주어지며 허용 가능한 값의 범위가 열 4에 표시됩니다. 이 방법은 게놈에 대한 실질적인 정보가 제공되는 모든 유기체에 대한 실험 설정을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 실험실에서 성장 스트레스 유도 후 발생하는 쌀과 보리의 전사적 변화를 비교하고 분석할 수 있었습니다.
