Este protocolo es significativo porque, hasta donde sabemos, es el primero en describir un nuevo metal basado en centrífugas para la purificación cinética de polisomas a partir de nódulos simbióticos de soja. La gran ventaja de esta técnica es que en combinación con RNA-Seq, permite el estudio de la relación y organizada en un tejido complejo como es el nódulo simbiótico. Para empezar, pese aproximadamente 0,2 gramos de nódulos intactos en un plato de pesaje y transfiéralos a un tubo de dos mililitros preenfriado.
Luego agregue 1.2 mililitros de tampón de extracción de polisomas, deje que la muestra se descongele durante dos minutos y homogeneice con un molinillo de tejido hasta la interrupción completa y la homogeneización de los nódulos. A continuación, incubar las muestras en hielo con una agitación suave durante 10 minutos o hasta que todas las muestras hayan sido procesadas y centrifugar a 16, 000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para granular los desechos. Luego, recupere el sobrenadante y repita el paso de la centrífuga.
Después de recuperar cuidadosamente el extracto citosólico clarificado, transfiera una alícuota de 200 microlitros a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros para un aislamiento total. Luego, vierta 4.5 mililitros de la capa de sacarosa al 33.5% en los tubos de centrífuga y agregue 4.5 mililitros de la capa al 12% con cuidado y lentamente con una micropipeta P-1000. A continuación, coloque los tubos en hielo hasta la adición del extracto citosólico clarificado.
Cargue un mililitro del extracto citosólico clarificado en la parte superior del cojín de sacarosa pipeteando cuidadosamente en la pared lateral del tubo. Luego, transfiera los tubos de ultracentrífuga a cubos preenfriados y centrifugar a 217, 874 G durante dos horas a cuatro grados centígrados. Después de desechar el extracto citosólico restante y el cojín de sacarosa, vuelva a suspender el pellet polisomal con 200 microlitros de tampón de resuspensión preenfriado.
A continuación, incubar durante 30 minutos en hielo y luego transferir la resuspensión polisomal a tubos preenfriados de 1,5 mililitros para proceder con la extracción de ARN. Después de homogeneizar las muestras con 750 microlitros del reactivo de aislamiento de ARN incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue 200 microlitros de cloroformo frío y agite los tubos vigorosamente durante 15 segundos.
A continuación, incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Centrifugar a 12, 000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para la separación de fases, y transferir 500 microlitros de la fase acuosa superior a un tubo limpio sin alterar la fase orgánica rosada. Luego, agregue 375 microlitros de isopropanol frío y 0.5 microlitros de glucógeno libre de ARN.
Después, mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar la mezcla durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y centrifugar a 12, 000 veces G durante 15 minutos. Luego, deseche el sobrenadante y lave el precipitado de ARN con un mililitro de etanol frío, al 75%.
Mezclar por vórtice breve. A continuación, centrifugar a 7, 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y seque al aire el pellet de ARN.
Luego, disuelva el pellet en 50 microlitros de agua libre de ARN e incube a 65 grados centígrados durante cinco minutos. Evaluar la concentración e integridad de ARN con electroforesis capilar altamente sensible y, o electroforesis en un gel de agarosa libre de ARN al 2%. Después de estimar el volumen de la muestra, agregue 0.1 volúmenes de tres molares de acetato de sodio, tres volúmenes de etanol frío y 0.5 microlitros de ARN, glucógeno libre.
Luego, mézclalos bien. Se realizó electroforesis capilar para varias fracciones de muestra de ARN asociadas totales y polisomales, que demostraron bandas de ARN ribosómicas afiladas, sin ningún aspecto manchado. Sin embargo, esto no se refleja en los valores de RIN, ya que oscilan entre 5,9 y 7,5, lo que corresponde a muestras no intactas.
El bioanalizador no pudo identificar los picos 18S y 25S como se ve en los electroferogramas, tanto para muestras de ARN totales como polisomas asociadas. No había signos visuales de degradación de la muestra. Sin embargo, se analizó una muestra para visualizar el resultado de una muestra casi completamente degradada, para su comparación.
Lo más importante es trabajar en condiciones de preservación de polisomas y ARN durante todo el protocolo. Después de secuenciar las fracciones de ARN total y par, se pueden utilizar patrones estándar para la expresión génica analizada para identificar genes de expresión diferencial a nivel de transcripción y traducción.
