Este protocolo proporciona una metodología estandarizada para la preparación y manipulación de tejido muscular en entornos preclínicos y ensayos clínicos, que es importante para obtener resultados confiables dentro del campo dmD. Las técnicas son relevantes para omitir las pruebas de exón para DMD. Y la principal ventaja es que, están bien establecidos y reproducibles si se llevan a cabo colectivamente.
Estas técnicas se centran principalmente en la omisión de exones en DMD, pero con un cambio de imprimaciones, se pueden aplicar las mismas técnicas a otras enfermedades tratadas con terapias de empalme. Estos métodos se pueden utilizar para lograr la eficiencia de salto de exón tanto como el ARN y la proteína. Para preparar una muestra para el análisis, primero mezcle volúmenes iguales de goma de tragacanto y agua hasta que la encía se vuelva suave y pegajosa.
Cargue esta mezcla en jeringas de 25 mililitros y dispense de 0,5 a un centímetro de goma en discos de corcho individuales. Etiquete los discos en el lado opuesto y coloque un recipiente de isopentano en nitrógeno líquido hasta que parte del líquido se congele. Coloque cada espécimen en la encía del tragacanto en los discos con un eje longitudinal de cada músculo perpendicular al corcho.
Coloque la goma alrededor de la parte inferior de cada músculo para ayudar a mantener el músculo en su lugar, y utilice pinzas para congelar las muestras en el isopentano frío. Mueva los especímenes continuamente durante un minuto o hasta que estén completamente congelados antes de colocarlos temporalmente sobre hielo seco. A continuación, coloque los especímenes en viales de vidrio para un almacenamiento de 80 grados centígrados.
Para secuestre el tejido muscular congelado para su análisis, establezca un criostato a una temperatura de trabajo de 25 grados Celsius, y para montar el bloque muscular en el soporte. Recorte el bloque de tejido hasta que se logren secciones planas. Para el análisis de la transcriptasa inversa PCR y Western blot, obtenga rodajas gruesas de 10 micrómetros.
Para el análisis inmunohistoquímico, obtener rodajas de seis a ocho micrómetros de espesor, y para la tinción de hematoxilina y eosina, obtener rodajas de 10 a 12 micrómetros de espesor. Después de su adquisición, coloque las secciones cortadas en dos tubos mililitros. Almacene las muestras para PCR e hinchazón occidental a 80 grados centígrados.
Aquí, se muestran el sistema de electroforesis de microchip, un gel de imágenes de reacciones de PCR de transcriptasa inversa y los resultados de secuenciación de la banda omitida de dos pacientes antes y después del tratamiento con un oligonucleótido antisorés en una fase de aumento de dosis de un ensayo. Ambos pacientes albergan deleciones. Como era de esperar, antes del tratamiento, ambos pacientes no mostraron saltos y sólo se podía visualizar una banda no omitida.
Después de 12 semanas de tratamiento, se visualizó una banda inferior clara omitida para el segundo paciente, sin embargo, todavía era difícil detectar cualquier producto omitido para el primer paciente. Los resultados de la secuenciación mostraron una concatenación de exones 47 y 54 para el segundo paciente, y exones, 44 y 54 para el primer paciente. Para calcular el porcentaje omitido, la concentración molar para la banda omitida se dividió por las bandas omitidas y no desfaladas.
Como era de esperar, ninguna banda de distrofina fue detectada por Western blot antes del tratamiento. Después del tratamiento, se detectó una banda del segundo paciente con un menor peso molecular en comparación con la observada en el control saludable. El primer paciente, sin embargo, no mostró niveles detectables de distrofina después del tratamiento.
Es fundamental manejar el tejido muscular correctamente, y colocar cada espécimen en la encía del tragacanto de manera consistente. Las secciones de tejido se pueden analizar de varias maneras diferentes, incluyendo artificial a PCR, PCR digital, mancha occidental, inmunohistoquímica, y con diferentes tipos de omics. Estas técnicas se pueden acelerar, el desarrollo, exón adicional omitiendo medicamentos dirigidos a diferentes exones, y se pueden aplicar al desarrollo de la base viral y de nuevo en la edición de DMD.
