이 프로토콜은 임상 전 설정 및 임상 시험에서 근육 조직을 준비하고 처리하기위한 표준화 된 방법론을 제공하며, 이는 DMD 분야 내에서 신뢰할 수있는 결과를 얻는 데 중요합니다. 이 기술은 DMD에 대한 엑슨 건너뛰기 트라이아웃과 관련이 있습니다. 그리고 주요 장점은, 그들은 잘 설립되고 집단적으로 수행하면 재현 할 수 있다는 것입니다.
이러한 기술은 주로 DMD에서 엑슨 건너뛰기에 초점을 맞추고 있지만 프라이머의 변화로 접합 치료로 치료받는 다른 질병에 동일한 기술을 적용 할 수 있습니다. 이러한 방법은 RNA와 단백질 모두 엑슨 건너뛰기 효율을 달성하는 데 사용될 수 있다. 분석을 위해 샘플을 준비하려면 먼저 잇몸이 부드럽고 끈적거리게 될 때까지 동일한 양의 트라가칸스 껌과 물을 섞습니다.
이 혼합물을 25 밀리리터 주사기에 적재하고 개별 코르크 디스크에 잇몸의 0.5~1센티미터를 분배합니다. 반대쪽에 디스크를 라벨과 액체의 일부가 동결 될 때까지 액체 질소에 isopentane의 용기를 배치합니다. 각 표본을 코르크에 수직으로 각 근육의 세로 축을 사용하여 디스크의 tragacanth 껌에 넣습니다.
각 근육의 바닥에 잇몸을 놓고 근육을 제자리에 고정시키고 핀셋을 사용하여 차가운 시편을 동결시 비춥시다펜탄을 고정하십시오. 시편을 1분 동안 또는 완전히 얼릴 때까지 계속 움직이면 일시적으로 드라이 아이스에 놓습니다. 그런 다음 시편을 유리 바이알에 넣고 섭씨 80도 보관합니다.
분석을 위해 냉동 근육 조직을 단면하려면 극저온을 섭씨 25도의 작동 온도로 설정하고 근육 블록을 홀더에 장착합니다. 평평한 단면이 달성될 때까지 조직 블록을 다듬습니다. 역전사 PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 10 마이크로미터 두께의 슬라이스를 얻습니다.
면역 조직 화학 적 분석을 위해, 6 ~ 8 마이크로 미터 두께의 조각을 얻고 헤마톡클린과 에오신 염색을 위해 10 ~ 12 마이크로 미터 두께의 조각을 얻습니다. 그들의 인수 후, 두 밀리 리터 튜브에 슬라이스 섹션을 배치합니다. PCR 및 서부 블로팅 샘플을 섭씨 80도에 저장합니다.
여기서, 마이크로칩 전기포고이스 시스템, 역실사 PCR 반응의 겔 이미지, 및 투여량 에스컬레이션 단계에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하기 전과 후에 두 환자로부터 건너뛴 밴드의 시퀀싱 결과가 1상 시험으로 나타났다. 두 환자 모두 삭제를 항구합니다. 예상대로, 치료 전에, 두 환자는 건너 뛰지 않았고 비 건너 뛴 밴드만 시각화 할 수 있었습니다.
12주 간의 치료 후, 두 번째 환자를 위해 명확한 건너뛴 하반역이 시각화되었지만, 첫 번째 환자를 위해 건너뛴 제품을 감지하는 것은 여전히 어려웠습니다. 시퀀싱 결과는 제2 환자를 위한 엑슨 47 및 54의 연결, 그리고 exons, 44 및 54 첫번째 환자를 위한 연결을 보여주었습니다. 건너뛴 백분율을 계산하기 위해 건너뛴 대역의 어금니 농도는 건너뛰고 건너뛰지 않은 밴드로 나뉘었다.
예상대로, 치료 전에 서양 얼룩에 의해 디스트로핀 밴드가 발견되지 않았습니다. 치료 후, 건강한 대조군에서 관찰된 것과 비교하여 분자량이 낮은 제2 환자로부터 밴드가 검출되었다. 첫 번째 환자, 그러나, 치료 후 dystrophin의 검출 가능한 수준을 보여주지 않았다.
근육 조직을 올바르게 처리하고 각 표본을 tragacanth 껌에 일관된 방식으로 배치하는 것이 중요합니다. 조직 단면도는 PCR, 디지털 PCR, 서양 얼룩, 면역 조직 화학 및 다른 유형의 오믹스로 인공을 포함하여 여러 가지 방법으로 분석 될 수 있습니다. 이러한 기술은 다른 엑슨을 대상으로 하는 추가 엑슨 건너뛰기 약물을 가속화할 수 있으며, DMD에 대한 편집에서 바이러스 성 기반의 개발에 적용될 수 있다.
