Nuestro protocolo permite el aislamiento y la separación de KRAS debidamente procesado a alto rendimiento. La producción de KRAS auténticamente farnesilada y carboximetilada permite realizar experimentos que tienen KRAS en su membrana al igual que en las células de mamíferos. El alto rendimiento del protocolo lo diferencia del trabajo anterior.
Normalmente purificamos de tres a cinco miligramos de proteína por litro de material de expresión. Esto nos permite llevar a cabo una variedad de experimentos biofísicos y de biología estructural. KRAS está mutado en el 20% de los cánceres y el 90% en cánceres de páncreas.
Así que tener un protocolo para producir proteína auténticamente procesada es bastante útil para el desarrollo de pantallas de drogas para que pueda estudiar la proteína real como lo sería en la membrana de las células cancerosas. Este protocolo también es muy útil para estudiar otras proteínas que están farnesiladas y completamente procesadas en las células. Y como tal, todo lo que necesita hacer es cambiar el KRAS con la proteína de interés y ponerlo en el baculovirus.
Los pasos críticos son los que rodean la cromatografía de intercambio catióntico. El uso de la columna adecuada y la limitación del tiempo que la proteína está en un tampón de sal baja son esenciales para el éxito. Entender que la precipitación no es un tipo de evento de globo de nieve ayuda a guiar a los nuevos en el protocolo.
Esto se refuerza mostrando la necesidad de dividir la carga de la columna de intercambio catiónica en varias cargas más pequeñas. Después de la elección de las células, la aclaración del analito, y la purificación de la proteína diana por IMAC, analizar las fracciones de proteína utilizando la página SDS y la tinción de Coomassie. Agrupa las fracciones máximas y marca la piscina durante la noche contra dos litros de tampón D a cuatro grados centígrados.
Al día siguiente, retire la muestra de diálisis y centrifugarlo a 4.000 veces g durante 10 minutos para eliminar cualquier precipitado. La muestra dialilizada y clarificada final a menudo sigue siendo brumosa, pero se puede aplicar a la columna CEX sin procesamiento adicional. Preparar la columna de intercambio catiónica de 20 mililitros lavándola con tres volúmenes de columna de tampón G, luego con tres volúmenes de columna de tampón F.Next, diluir 20 mililitros de la muestra dializada a una concentración final de cloruro de sodio de 100 mililitros añadiendo 20 mililitros de buffer E y aplicar la muestra a la columna de intercambio.
Es fundamental diluir la pequeña cantidad de la muestra en lugar de todas a la vez y las muestras diluidas se deben aplicar a la columna inmediatamente después de la dilución para limitar la precipitación de la proteína. Continúe cargando la columna con muestra recién diluida a medida que la dilución anterior se acerca al final de la carga. A continuación, lave la columna hasta la absorbancia de línea base 280 con el búfer F, que normalmente requiere tres volúmenes de columna.
Eluir la proteína de la columna con un gradiente de 400 mililitros del tampón F al 65%buffer G, recogiendo el eluyente en fracciones de seis mililitros. Una vez completado el gradiente, continúe lavando la columna para obtener volúmenes adicionales de 1,5 columnas de 65%buffer G.Elija las fracciones positivas basadas en la página SDS y el análisis de manchas De Coomassie Blue, así como la inspección del rastro UV del cromatograma. Luego une la proteína y digiere con His6 TEV proteasa de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Después de la digestión y la diálisis, cargue la proteína en una columna IMAC de 20 mililitros equilibrada con tampón A a tres mililitros por minuto. Recoger siete fracciones de mililitros durante esta cromatografía y lavar la columna con un total de tres volúmenes de columna de tampón A o hasta que se alcance la absorbancia basal. Eluda la proteína diana con un gradiente de volumen de cinco columnas del tampón C del 0% al 10% y recoja siete fracciones de mililitros.
A continuación, identifique las fracciones positivas con la página SDS. Cuando se analiza con la página SDS, el lysate clarificado debe contener una banda oscura que migra a unos 65 kilodaltones que corresponde a la proteína de fusión His6-MBP-tev-KRAS4b. El FNTAb co-expresado migra a 48 kilodaltons.
El paso CEX dentro de la purificación es crítico porque reduce el alcance de la proteólisis y enriquece la proteína totalmente procesada, pero es la parte más complicada del protocolo. Un resultado típico de este paso tiene un pico prominente tres con el KRAS4b-FMe, pero los perfiles de elución pueden ser variables. El análisis de masa intacto utilizando ESIMS confirma la masa molecular precisa de las proteínas y, por lo tanto, la proporción relativa de farnesilación o carboximetilación.
Mientras que los lotes finales típicos contenían algunos KRAS4b-FARN detectables, esta proporción era inferior al 15% en términos de altura máxima a partir de este análisis. El análisis de masa nativo se utilizó para determinar la masa del KRAS4b vinculado al PIB. El disolvente de muestra se cambió por acetato de amonio para garantizar una ionización más suave que permite que el complejo nativo permanezca intacto.
La interacción de KRAS4b-FMe y los liposomas se midió con resonancia de plasmon superficial para validar que la farnesilación y la carboximetilación son necesarias para que KRAS4b-FMe se una a las membranas. Como era de esperar, KRAS4b-FMe se unió a los liposomas, mientras que KRAS4b sin procesar no lo hizo. Minimizar el tiempo que la proteína está expuesta a la sal baja es el aspecto más crítico del protocolo que afecta el rendimiento.
La proteína sólo está brevemente en esta baja concentración de sal después de la dilución en el tampón E.La proteína se puede utilizar para una variedad de experimentos biofísicos que utilizan miméticos de membrana como liposomas o nanodiscos para investigar con qué lípidos interactúa KRAS. Usando estos datos, podemos comenzar a extrapolar cómo KRAS interactúa con la membrana plasmática de la célula. Utilizando KRAS-FMe purificado, nuestros colegas fueron capaces de resolver la estructura de cristal de rayos X de KRAS en complejo con un chaperone que es específico para la forma farnesilada y metilada de esta proteína.
