Unser Protokoll ermöglicht die Isolierung und Trennung von ordnungsgemäß verarbeitetem KRAS bei hoher Ausbeute. Die Herstellung von authentisch farnesylierten und carboxymethylierten KRAS ermöglicht Experimente, die KRAS in ihrer Membran haben, genau wie in Säugetierzellen. Die hohe Ausbeute des Protokolls hebt es von früheren Arbeiten ab.
Wir reinigen in der Regel drei bis fünf Milligramm Protein pro Liter Expressionsmaterial. Dies ermöglicht es uns, eine Vielzahl von biophysikalischen und strukturbiologischen Experimenten durchzuführen. KRAS ist bei 20% der Krebsarten und 90% bei Bauchspeicheldrüsenkrebs mutiert.
Ein Protokoll zur Herstellung von authentisch verarbeitetem Protein ist also sehr nützlich für die Entwicklung von Medikamenten-Screens, so dass Sie das eigentliche Protein wie auf der Membran von Krebszellen studieren können. Dieses Protokoll ist auch sehr nützlich für die Untersuchung anderer Proteine, die in den Zellen farnesyliert und vollständig verarbeitet sind. Und als solches, alles, was Sie tun müssen, ist das KRAS mit dem Protein von Interesse tauschen und setzen Sie es in das Baculovirus.
Die entscheidenden Schritte sind die rund um die Kationenaustauschchromatographie. Die Verwendung der richtigen Säule und die Begrenzung der Zeit, in der sich das Protein in einem niedrigen Salzpuffer befindet, sind für den Erfolg unerlässlich. Zu verstehen, dass der Niederschlag kein Ereignis vom Typ der Schneekugel ist, hilft, die Neuen zum Protokoll zu führen.
Dies wird durch die Notwendigkeit verstärkt, die Ladung der Kationenaustauschsäule in mehrere kleinere Lasten aufzuteilen. Nach dem Lysing von Zellen, der Klärung des Lysats und der Reinigung des Zielproteins durch IMAC, analysieren Sie die Proteinfraktionen mit SDS-Seite und Coomassie-Färbung. Die Spitzenfraktionen bündeln und das Becken über Nacht gegen zwei Liter Puffer D bei vier Grad Celsius dialysieren.
Am nächsten Tag die Probe von der Dialyse entfernen und bei 4.000 mal g für 10 Minuten zentrifugieren, um jeglichen Niederschlag zu entfernen. Die endgültige dialyzierte und geklärte Probe ist oft noch trübe, kann aber ohne weitere Verarbeitung auf die CEX-Säule aufgetragen werden. Vorbereiten Sie 20 Milliliter Kationenaustauschsäule, indem Sie sie mit drei Spaltenvolumen Puffer G waschen, dann mit drei Spaltenvolumen Puffer F.Next 20 Milliliter der Dialyseprobe auf eine endgültige Natriumchloridkonzentration von 100 Millimolar verdünnen, indem Sie 20 Milliliter Puffer E hinzufügen und die Probe auf die Austauschsäule auftragen.
Es ist wichtig, die kleine Menge der Probe auf einmal zu verdünnen und die verdünnten Proben sollten unmittelbar nach der Verdünnung auf die Säule aufgetragen werden, um die Ausfällung des Proteins zu begrenzen. Fahren Sie mit der Ladung der Säule mit frisch verdünnter Probe fort, da sich die vorherige Verdünnung dem Ende der Last nähert. Waschen Sie dann die Spalte auf Basisabsorption 280 mit Puffer F, die in der Regel drei Spaltenvolumen erfordern.
Elute das Protein aus der Säule mit einem 400 Milliliter Gradienten von Puffer F zu 65%Puffer G, sammeln das Eluent in sechs Milliliter Fraktionen. Sobald der Farbverlauf abgeschlossen ist, waschen Sie die Spalte weiter für ein zusätzliches 1,5-Säulen-Volumen von 65%Puffer G.Wählen Sie die positiven Brüche basierend auf SDS-Seite und Coomassie Blue Fleckenanalyse sowie Inspektion der UV-Spur des Chromatogramms. Dann bündeln Sie das Protein und verdauen Sie es mit His6 TEV Protease nach Manuskriptanweisungen.
Nach Verdauung und Dialyse das Protein auf eine 20-Milliliter-IMAC-Säule laden, die mit Puffer A mit drei Millilitern pro Minute ausgeglichen wird. Sammeln Sie während dieser Chromatographie sieben Milliliter-Fraktionen und waschen Sie die Säule mit insgesamt drei Spaltenvolumen des Puffers A oder bis die Basisabsorption erreicht ist. Elute das Zielprotein mit fünf Spalten Volumengradient von Puffer C von 0% bis 10% und sammeln sieben Milliliter-Fraktionen.
Identifizieren Sie dann die positiven Brüche mit der SDS-Seite. Bei der Analyse mit der SDS-Seite sollte das geklärte Lysat ein dunkles Band enthalten, das auf etwa 65 Kilodalton emigriert, was dem Fusionsprotein His6-MBP-tev-KRAS4b entspricht. Der mitausgedrückte FNTAb wandert auf 48 Kilodalton.
Der CEX-Schritt innerhalb der Reinigung ist entscheidend, da er das Ausmaß der Proteolyse reduziert und das vollständig verarbeitete Protein bereichert, aber der komplizierteste Teil des Protokolls ist. Ein typisches Ergebnis dieses Schritts hat mit dem KRAS4b-FMe einen prominenten Spitzenwert von drei, aber die Elutionsprofile können variabel sein. Intakte Massenanalysen mit ESIMS bestätigen die genaue Molekularmasse der Proteine und damit den relativen Anteil der Farnesylierung oder Carboxymethylierung.
Während typische Endlose einige nachweisbare KRAS4b-FARN enthielten, betrug dieser Anteil in Bezug auf die Spitzenhöhe dieser Analyse weniger als 15%. Native Massenanalyse wurde verwendet, um die Masse des KRAS4b an das BIP gebunden zu bestimmen. Das Probenlösungsmittel wurde gegen Ammoniumacetat ausgetauscht, um eine weichere Ionisation zu gewährleisten, die es dem nativen Komplex ermöglicht, intakt zu bleiben.
Die Wechselwirkung von KRAS4b-FMe und Liposomen wurde mit Oberflächen-Plasmonresonanz gemessen, um die Farnesylierung zu validieren und Carboxymethylierung erforderlich sind, damit KRAS4b-FMe an Membranen binden kann. Wie erwartet, KRAS4b-FMe gebunden an die Liposomen, während unverarbeitet KRAS4b nicht. Die Minimierung der Zeit, in der das Protein salzarmen Salz ausgesetzt ist, ist der kritischste Aspekt des Protokolls, der die Ausbeute beeinflusst.
Das Protein ist nur kurz bei dieser niedrigen Salzkonzentration nach der Verdünnung in Puffer E.Das Protein kann für eine Vielzahl von biophysikalischen Experimenten verwendet werden, die Membranmimetik wie Liposomen oder Nanoscheiben verwenden, um zu untersuchen, mit welchen Lipiden KRAS interagiert. Anhand dieser Daten können wir damit beginnen, zu extrapolieren, wie KRAS mit der Plasmamembran der Zelle interagiert. Mit gereinigtem KRAS-FMe konnten unsere Kollegen die Röntgenkristallstruktur von KRAS in Komplex mit einem Chaperon lösen, das spezifisch für die farnesylierte und methylierte Form dieses Proteins ist.
