Sólo y sólo proteínas de unión controlan múltiples procesos biológicos. Este método FLAG-Biotin CLIP-seq, por lo tanto, para perfilar globalmente la disposición especial y temporal de RNAs y RBP en células de mamíferos. Este método permite la detección eficiente de ARN directos unidos a proteínas sin SDS-PAGE y los procedimientos de transferencia de membrana.
En comparación con el CLIP-seq tradicional es libre de isótopos y no requiere anticuerpo específico para proteínas. Comience por enchapar alrededor de 3 millones de células STEM embrionarias de ratón en una placa de 10 centímetros e incubarlas durante la noche. Al día siguiente, retire el medio con un vacío y trate las células con dos mililitros de 0,25% de trippsina EDTA durante dos minutos a temperatura ambiente.
Aprieta la tripina con cuatro mililitros de medio MESC fresco, y transfiere las células a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Luego, centrifugarlos a 300 veces G durante tres minutos a cuatro grados centígrados y quitar el sobrenadante. Suspenda las células en cuatro mililitros de PBS frío y transfiérelos de vuelta a la placa de 10 centímetros para la reticulación.
Radiar las células con una luz UV de 254 nanómetros, luego transferir las células reticuladas a un tubo de 15 mililitros. Gire hacia abajo estas células a 300 veces G durante tres minutos a cuatro grados celsius, luego retire el sobrenadante ylyse las células con 500 microlitros de búfer A preparados de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Transfiera las células a un tubo de 1,5 mililitros libre de RNAse, e incubarlas a cuatro grados Celsius con rotación suave durante 30 a 60 minutos.
Tratar el liso con 30 microlitros de DNAse 1 a 37 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, detenga la reacción añadiendo cuatro microlitros de 0,5 molares EDTA. Gire hacia abajo el pellet insoluble centrifugando a 12.000 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados, y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo precalentado de 1,5 mililitros.
Transfiera el izado celular a cuentas FLAG preequilibadas, e incuba la muestra a cuatro grados centígrados mientras gira durante dos a cuatro horas. Después de la incubación, centrifugar las perlas durante dos minutos a 3000 veces G y retire el sobrenadante. Añadir 500 microlitros de Buffer A a la muestra, e incubar a 4 grados Celsius durante cinco minutos, luego girar hacia abajo las cuentas y quitar el sobrenadante.
Repita el lavado con Buffer A, seguido de dos lavados con Tampón precaleado B.To eluido con un péptido FLAG X, prepare la solución de elución como se describe en el manuscrito de texto y gire hacia abajo las cuentas FLAG. Retire el sobrenadante con una punta de pipeta de extremo estrecho y agregue 200 microlitros de la solución de tres laución X FLAG a cada muestra. Incubar las muestras durante 30 minutos a cuatro grados centígrados con rotación suave.
A continuación, gire hacia abajo las cuentas durante dos minutos a 3000 veces G.Transferir el supernado a un tubo fresco y repetir la elución dos veces. Ahorre el 5% de los eluyentes para el análisis de manchas occidentales o la tinción de plata para comprobar la eficiencia de la inmunoprecipitación FLAG. Transfiera los eluyentes tirados a las cuentas de estreptavidina preparadas y gire suavemente las muestras a cuatro grados centígrados durante una a tres horas o durante la noche.
A continuación, recoger las perlas en un soporte magnético y quitar el sobrenadante. Lave las perlas dos veces con 500 microlitros de Tampón C con rotación suave durante cinco minutos por lavado. A continuación, lave las perlas dos veces con 500 microlitros de Buffer D, y dos veces con 500 microlitros de tampón PNK helado, recogiendo las perlas en el soporte magnético y quitando el sobrenadante entre lavados.
Para realizar la digestión parcial del ARN, añada 100 microlitros de solución de MNA a cada muestra y el vórtice se ajuste a 37 grados Centígrados con un mezclador térmico durante 10 minutos. Recoger las perlas con un soporte magnético durante 30 segundos y quitar el sobrenadante. A continuación, lávelos con el búfer PNK-EDTA, el búfer Tampón C y el búfer PNK según las instrucciones del manuscrito.
Recoger las perlas con el soporte magnético y quitar el tampón. A continuación, agregue la mezcla de reacción CIP y el vórtice las perlas a 37 grados Celsius con un mezclador térmico durante 10 minutos. Lave rápidamente las cuentas dos veces con 500 microlitros de tampón PNK EDTA helado, seguidos de dos lavados con 500 microlitros de tampón PNK helado.
Después de los lavados, agregue 40 microlitros de tres mezclas de ligadura de enlace principal a las perlas, y vórtice a 16 grados Celsius con un mezclador térmico durante tres horas o durante la noche. La ligadura eficiente del vinculador a los aliados es fundamental para este experimento. Compruebe el tubo de reacción ocasionalmente para asegurarse de que estos no se precipitan durante la ligadura.
Después de la incubación, repita los lavados con tampones PNK EDTA y PNK, agregue 40 microlitros de PNK mezclados a las perlas, y vórquelos a 37 grados Celsius con el mezclador térmico durante 10 minutos. Lave las cuentas con los búferes PNK EDTA y PNK y, a continuación, proceda con el aislamiento de ARN como se describe en el manuscrito de texto. En comparación con la purificación de afinidad por un paso mediada por FLAG o streptavidina, la purificación en tándem FLAG-Biotin eliminó casi todas las proteínas purificadas principales, evitando la contaminación de las interacciones indirectas del ARN proteico.
LIN28 y WDR43, Fbio CLIP-seq se realizó utilizando células STEM embrionarias de ratón. En total, se recuperaron alrededor de 7,7 millones y 2,2 millones de lecturas únicas para LIN28 y WDR43 respectivamente. La comparación de las vistas de pista muestra diferentes patrones de encuadernación en el locus de RN45 pre-rRNA.
Los sitios reticulados en el motivo GGA G de ARN pre-let7-g de LIN28, Fbio CLIP-seq o identificados. Además, se determinaron motivos de ARN enriquecido en los sitios de unión y el porcentaje de nucleótidos mutados en diferentes tipos de mutaciones. Mostrando que LIN28 prefiere unirse al nucleótido genético.
Bueno, a las 10:00 PM, este protocolo, es importante confirmar la eficiencia de la inmunoprecipitación para asegurarse de que los complejos de proteínas sólo se purificaron con éxito.
