Este protocolo permite la identificación de socios de unión a proteínas de una secuencia de ARN conocida tirando de ellos hacia abajo del extracto celular utilizando oligonucleótidos de ARN biotinilados. En comparación con los métodos que requieren detergentes o altas temperaturas para separar las proteínas del ARN, estos protocolos utilizan condiciones muy suaves que permiten también preservar posibles complejos de proteínas. Demostrando el procedimiento estará Jakob Rupert, un estudiante de doctorado bajo mi disposición.
Comience la cosecha total de proteínas retirando el medio de los pocillos de la placa celular HEK 293T y lave los pocillos de las seis placas de pocillos con un mililitro de PBS. Deseche PBS y transfiera las placas al hielo, antes de agregar 200 microlitros de tampón de lisis a cada pozo. Separe y rompa las células con un raspador celular antes de transferir el extracto celular derivado de dos pocillos en el mismo tubo de 1,5 mililitros.
Después de 30 minutos de incubación en hielo y centrifugación, transfiera el sobrenadante a un tubo preenfriado. A continuación, calcule el volumen de extracto de proteína correspondiente a 1,5 miligramos de proteínas. Luego lleve todas las muestras a un volumen final de 600 microlitros usando un tampón de lisis.
Mantenga las muestras en hielo hasta que las use. Para preparar las cuentas, mézclelas en el búfer de almacenamiento moviendo el tubo. Después de calcular los 100 microlitros de medio de suspensión por muestra, coloque el volumen calculado de la suspensión en una rejilla magnética.
Para lavar las perlas, retire la solución de almacenamiento y lave las perlas agregando un mililitro de tampón de lisis e invirtiéndolo manualmente. A continuación, retire el tampón con la rejilla magnética y repita el paso de lavado. A las perlas, agregue un volumen de tampón de lisis igual al volumen inicial del medio de lodo, y mézclelo moviendo el tubo antes de dispensar el medio uniformemente en tantos tubos de 1,5 mililitros como muestras.
Para bloquear las perlas, retire el tampón con la rejilla magnética y agregue 600 microlitros de 0,25 miligramos por mililitro de solución de ARNr de levadura preparada en tampón de lisis. Incubarlo durante una hora a temperatura ambiente en una rueda giratoria. Retire la solución de TRNA con la rejilla magnética antes de agregar 600 microlitros de tampón de lisis y lávela mezclándola manualmente.
Repita el paso de lavado y deseche el tampón. Para cada tubo que contenga los 100 microlitros iniciales del medio de suspensión, prepare 200 microgramos de oligonucleótido de ARN en 600 microlitros de tampón de lisis. Agregue el oligo a las perlas e incube durante una hora a temperatura ambiente mientras gira.
Retire la solución de las perlas y lave dos veces con 600 microlitros de tampón de lisis girando los tubos durante cinco minutos cada uno a temperatura ambiente. Deseche el búfer. Para la unión de proteínas en perlas, separe 5% o 30 microlitros de volumen de la solución de proteína de 600 microlitros y manténgala como entrada o IN para un análisis posterior.
Agregue la mezcla de proteínas restante a cada tubo de perlas cargadas e incube con rotaciones lentas durante la noche a cuatro grados centígrados. Retire la fracción de proteína no unida de las perlas utilizando la rejilla magnética. Ahorre 5% o 30 microlitros de su volumen y etiquételo a través o FT. Agregue un mililitro de tampón de lavado 1 a las perlas y gírelo durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el tampón y repita este lavado una vez. Agregue un mililitro de tampón de lavado 2 a las perlas. Y después de incubar a cuatro grados centígrados en un rotador durante cinco minutos, deseche el sobrenadante.
Para eluyir los aglutinantes específicos, agregue 100 microlitros de tampón de elución 1 a las perlas. Después de mezclar manualmente con un movimiento, incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coloque los tubos en una batidora térmica y agite vigorosamente durante cinco minutos a 95 grados centígrados.
Luego coloque el tubo en la rejilla magnética y recoja la fracción eluyida en un tubo limpio. Una vez hecho esto, gire rápidamente las perlas con una centrífuga de banco para maximizar la recuperación del eluido. Y ahorre un 5% o cinco microlitros del volumen total de eluido o EL para análisis posteriores.
Las proteínas eluidas fueron identificadas por espectrometría de masas. El trazado de las proteínas significativamente enriquecidas en una gráfica volcánica reveló que el contenido total de proteínas y las proteínas enriquecidas eluidas del ARN eran significativamente mayores que el ARN, lo que sugiere que el ARN puede establecer un mayor número de interacciones específicas. Como ejemplos de la concordancia entre los resultados predichos y obtenidos, las puntuaciones de interacción para más ARN y menos ARN con proteínas del proteoma humano mostraron que se predijo que HNRNPH3 se uniría más ARN selectivamente, y PCBP2 para interactuar específicamente con ARN.
Además, se predijo que la proteína RBM41 sería promiscua para ambos oligonucleótidos de ARN. El análisis por espectroscopia de masas de muestras de ensayo de extracción de proteínas confirmó la presencia de HNRNPH3 en ARN y PCBP2 en menos ARN. Mientras que RBM41 se encontró que interactúa con ambos.
Se utilizó Western blot para detectar la presencia de TDP-43 en los resultados y pasos de optimización del protocolo. En el ARN, se observó TDP-43 en la muestra de entrada y el eluido, indicando su presencia desde el inicio. TDP-43 fue retenido por el ARN durante los pasos de lavado y fue eluydo al final con un tampón de sal alto.
Al mapear las interacciones de ARN de proteínas, este método puede revelar redes macromoleculares detrás de muchas vías fisiológicas. Por ejemplo, regulación transcripcional o mecanismos patológicos como el cáncer y la neurodegeneración.
